薛曉陽 朱彤彤 程自珍 李佳佳 王雪敏

（華裕農(nóng)業(yè)科技有限公司 河北 邯鄲 056000）

禽白血病(A vianleukosis virus，ALV)是由禽C型反錄病毒群的病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，主要是淋巴細(xì)胞性白血病，其次是成紅細(xì)胞性白血病、成髓細(xì)胞性白血病。此外還可引起骨髓細(xì)胞瘤、結(jié)締組織瘤、上皮腫瘤、內(nèi)皮腫瘤等。禽白血病的傳播方式分為垂直傳播及水平傳播，其中經(jīng)卵垂直傳播是禽白血病的主要傳播方式，家禽感染禽白血病后可造成雞只生長發(fā)育遲緩、產(chǎn)蛋性能下降、免疫抑制等影響[1]。同品種雞的飼養(yǎng)呈現(xiàn)規(guī)?；?、集約化發(fā)展，蛋雞、地方品種雞感染J亞群ALV的病例報道不斷增多[2]。禽白血病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失主要有2個方面：一是產(chǎn)生腫瘤，導(dǎo)致雞的死亡；二是產(chǎn)生非腫瘤綜合征。此外，禽白血病一當(dāng)感染后，可引起雞群的免疫抑制，會繼發(fā)諸如馬立克氏病、傳染性法氏囊、雞傳貧等免疫抑制病，從而造成更嚴(yán)重的損失[3]。本檢測病例具有典型臨床癥狀，主要表現(xiàn)為高死亡率，解剖為肝臟腫大，懷疑為腫瘤性疾病，因此對該場區(qū)采集雞蛋進(jìn)行P27抗原檢測，評估該疾病和白血病的關(guān)系。其中該場區(qū)共有4個棟舍，全部進(jìn)行采樣評估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 DF-1細(xì)胞 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)腫瘤與免疫抑制病實驗室惠贈。肝素鈉抗凝管購自江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司，EDTA-K2抗凝管購自山東省成武縣醫(yī)用制品廠。6孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國康寧公司。DMEM高糖培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家gibco，產(chǎn)品貨號8119159，有效期至2020.5。0.25胰酶，生產(chǎn)廠家gibco，產(chǎn)品貨號2008319，有效期至2020.9.30。青鏈霉素生產(chǎn)廠家gibco，產(chǎn)品貨號2068817，2020.1.30。兩性霉素B生產(chǎn)廠家procell，有效期至2020.6。胎牛血清：PAA品牌，生產(chǎn)日期SF181212。

1.1.2 試驗設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱(松下，型號MCO-18AC)、倒置顯微鏡(NⅠKON，型號TS2)、高壓滅菌鍋(博訊，型號YXQ-LS-50SⅠⅠ)、超純水系統(tǒng)(艾科浦公司生產(chǎn)，型號AWL-0501-H)、電熱干燥箱(上海博訊生產(chǎn)，型號GZX-9140MBE)、超凈工作臺(上海博訊公司生產(chǎn)，型號SW-CTLFD)、醫(yī)用離心機(湘儀設(shè)備，型號H1850)、酶標(biāo)儀(BⅠOTeK品牌，型號ELX800)、洗板機(BⅠOTeK品牌，型號ELX50)、移液器(eppendorf品牌)。

1.1.3 試劑 LLAg試劑盒(ⅠDEXX產(chǎn)品，貨號LP244，有效期至2020.5.18)。

1.1.4 雞蛋 4個棟各采集184雞蛋。

1.1.5 血樣 第4棟采集30份全血。

1.2 檢測方法

1.2.1 蛋清P27抗原檢測 嚴(yán)格按照ⅠDEXX試劑說明進(jìn)行。

1.2.2 樣品處理及接種細(xì)胞[4]（1）抗凝血：1500-2000r離心2min，取中間靠下層，注意不要取到紅細(xì)胞。本檢測使用12孔板接90μl，每孔加入過濾的肝素鈉抗凝劑20μl(12.5U/ml)。（2）接種完樣品后2h更換維持液，用滅菌的PBS清理清洗細(xì)胞板3次，每孔1ml/次，加入1%細(xì)胞維持液維持5d，維持5d后進(jìn)行傳代。（3）共傳2代，每一代的上清液都要留樣檢測。

1.2.3 細(xì)胞上清液白血病檢測 試劑為ⅠDEXX產(chǎn)品，嚴(yán)格按照試劑說明進(jìn)行。

2 檢測結(jié)果

2.1 蛋清P27蛋白

表1 蛋清P27蛋白檢測結(jié)果

2.2 全血白血病病毒

表2 全血白血病病毒分離結(jié)果

3 討論

（1）該場區(qū)2個棟舍蛋清白血病P27抗原檢測陽性率均較高，在30%以上，國家規(guī)定的蛋種雞抽檢不超過1%的陽性率，超標(biāo)較為嚴(yán)重，并且雞群存在腫瘤癥狀及較高死淘率。（2）2個棟舍采集全血進(jìn)行病毒分離，隨機采樣，結(jié)果均在10%以上病毒檢出，表明雞群存雞群確實存在病毒感染，并且DF-1細(xì)胞可以排除內(nèi)源性白血病，因此該分離株是致病性白血病可能性較大。（3）ALV-J引發(fā)的腫瘤/血管瘤給中國養(yǎng)雞業(yè)帶來了很大的危害。過去十多年全國已報道了100多個ALV-J毒株的分離鑒定，同時何愛飛等也有禽白血病所致血管瘤的報到[5]，王培坤等在三黃雞臨床血管瘤病例分離出A亞群與J亞群白血病病毒，說明臨床血管瘤有一定的病例，但是在一般企業(yè)實驗室診斷全面診斷技術(shù)較為困難，病理切片技術(shù)相對復(fù)雜，并且在結(jié)果讀取專業(yè)性要求較高，PCR方法白血病鑒定對分子理論要求較高，而細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)合ELⅠSA聯(lián)合診斷在企業(yè)應(yīng)用較為適用。

4 結(jié)論

本案例白血病臨床解剖不一定有明顯的腫瘤癥狀，雞群存在腫瘤癥狀，雞蛋蛋清高陽性率，本病例達(dá)到30%以上，結(jié)合病毒分離得出高蛋清P27陽性率，對疾病確診有指導(dǎo)意義，同時蛋清P27抗原檢測檢測較為方便，更適合基層化驗室使用。