張 圓 劉曉藝 高一珊 康貝寧 李增寬 趙 勇 閔令江*

（①山東省濟(jì)寧市畜牧業(yè)發(fā)展中心 272000 ②青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 山東 青島）

濟(jì)寧青山羊，其被毛由黑白二色毛混成青色，其角、蹄、唇為青色，前膝為黑色，有“四青一黑”的特征[1]，是優(yōu)良的羔皮用山羊品種，2006年該品種被農(nóng)業(yè)部列入《國家級畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》。性成熟早較、繁殖率高，肉質(zhì)優(yōu)良、風(fēng)味獨(dú)特，適應(yīng)性強(qiáng)，能夠生產(chǎn)花紋獨(dú)特的青猾子皮，使得濟(jì)寧青山羊享譽(yù)國內(nèi)外。作為中國本土品種，濟(jì)寧青山羊4月齡即可配種，母羊常年發(fā)情，發(fā)情周期17.5±0.5d，妊娠期147±2.5d，羔羊成活率95%[2]。羔羊初生重1.3±0.1kg，60日齡斷奶重4.0±0.5kg。山羊一般而言產(chǎn)單羔居多，濟(jì)寧青山羊年產(chǎn)兩胎或兩年產(chǎn)三胎，一胎多羔，平均產(chǎn)羔率293.65%[3]，但其個(gè)體較小、生長速度較慢，在大規(guī)模生產(chǎn)中不占優(yōu)勢。研究其生長發(fā)育的過程，提高生長速度，降低生產(chǎn)成本，將成為今后育種的主要目標(biāo)。

1996年，kiss-1基因在Lee等研究人黑素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力時(shí)，首次被發(fā)現(xiàn)其具有抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力，ss表示抑制物序列，ki取其發(fā)源地一種有名巧克力的前綴[4]。之后人們對其研究，確定其定位于人類染色體lq32-q41，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成[5]。由4個(gè)外顯子最終翻譯成得1個(gè)親水蛋白，由145個(gè)氨基酸組成，稱為“kisspeptins”[6]，又稱“親吻素”。之后的研究發(fā)現(xiàn)kiss-1能夠抑制多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，腫瘤的轉(zhuǎn)移與預(yù)后與kiss-1的表達(dá)下調(diào)關(guān)系密切[7]。此外有研究表明下丘腦中的kiss-1/GPR54(受體)信號通路作為參與調(diào)控哺乳動物青春期發(fā)育與性成熟的關(guān)鍵內(nèi)分泌因子—“親吻素”[8]，kisspeptins能夠激活GnRh的神經(jīng)元，在HPG軸(下丘腦-垂體-性腺軸)上游，通過調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌，刺激垂體門脈系統(tǒng)分泌LH、FSH對性腺產(chǎn)生作用，刺激雌激素、睪酮等激素合成，進(jìn)而促使卵子和精子的產(chǎn)生，使個(gè)體具備生殖能力，在生殖中起關(guān)鍵調(diào)控作用[9]。作為一種性早熟品種，濟(jì)寧青山羊在60～90d左右就能達(dá)到性成熟，進(jìn)入初情期，平均窩產(chǎn)活仔數(shù)為2.91只。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，縮短母羊達(dá)到性成熟的時(shí)間，有益于降低后備母羊的生產(chǎn)成本。因此研究濟(jì)寧青山羊中kiss-1基因與多種繁殖性狀之間的關(guān)聯(lián)，不論是從其通過kiss-1/GPR54信號通路刺激促性腺激素的釋放進(jìn)而調(diào)控一系列生殖激素從而影響動物的性成熟，還是通過kiss-1／GPR54系統(tǒng)調(diào)節(jié)胰島素的分泌進(jìn)而影響動物的消化和吸收從而影響其營養(yǎng)水平來調(diào)控動物的發(fā)情，都對于山羊在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的實(shí)際生產(chǎn)效益具有重要意義。

通過本研究，希望能夠發(fā)現(xiàn)kiss-1不用基因型在濟(jì)寧青山羊中與產(chǎn)羔數(shù)和初次配種時(shí)間的關(guān)系，從分子角度加快育種進(jìn)程，以期在實(shí)際生產(chǎn)中，通過DNA檢測，為不同基因型的山羊制定專屬的培育計(jì)劃，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)效益的最優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 本試驗(yàn)用到的濟(jì)寧青山羊來自山東嘉祥濟(jì)寧青山羊原種場，通過查閱系譜檔案材料，選取具有產(chǎn)羔數(shù)記載的年齡、體重基本一致的濟(jì)寧青山羊26只(連續(xù)3胎均產(chǎn)3羔或3羔以上的14只，連續(xù)3胎均產(chǎn)單羔的12只)，屠宰后取子宮組織凍存樣品。

1.1.2 儀器 金屬浴(南京沃拓儀器設(shè)備有限公司)、高速離心機(jī)(eppendorf生命科學(xué)公司)、旋渦混勻器(購自ⅠKA)、超微量分光光度計(jì)(購自上海美谷分子儀器有限公司)、Quick Drop超微量分光光度計(jì)(購自MOLECuLAR DEVⅠCES)、PCR擴(kuò)增儀(購自北京友華照欽醫(yī)療器械有限公司)、DYY-8C型電泳儀(購自北京市六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)(購自北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司)。

1.1.3 試劑 DNA提取試劑盒購于生工生物工程(上海)有限公司，內(nèi)含Buffer ACL、蛋白酶K、Buffer CL、吸附柱、CW1 Solution、CW2 Solution、CE Buffer等；PCR引物對(100 uMol)購于生工生物工程(上海)有限公司、2×Phanta Max Master Mix購于南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司，內(nèi)含Taq Plus DNA Polymerase、dNTP以及優(yōu)化的緩沖體系、2000的Marker購于BBⅠ、10×DNA loading Buffer購于Solarbio、DNA電泳緩沖液(50TAE)、核酸染料(4S Green Plus)、無菌超純水、BⅠOWEST REG MLAR AGAROSE(瓊脂糖干粉)、限制性內(nèi)切酶Acl Ⅰ、10×NEBuffer購于NEB公司、液氮、無水乙醇、超純水。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和濃度測定 試驗(yàn)方法中的基因組DNA提取和測定等技術(shù)均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)曹貴鈴等的研究，濟(jì)寧青山羊kiss-1基因在296位點(diǎn)發(fā)生了由鳥嘌呤堿基到胞嘧啶堿基的突變，從而能夠被限制性內(nèi)切酶識別[10]。針對目的基因kiss-1的內(nèi)含子1和內(nèi)含子2總長為1101bp的目的片段設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上下游引物由生工生物工程公司提供，引物序列為：上游引物：CTTGTGTTTGCTGGACAGT CT，下游引物：TGCTCCCTCCCAACCTTCTTT。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增選用20μl體系，選用0.5 ml離心管，按下表加入各試劑，試劑都放在冰上。

表1 PCR反應(yīng)體系 (μl)

將按順序加入各種試劑的PCR管在漩渦震蕩儀上震蕩搖勻后，在小型離心機(jī)上離心后放入PCR儀。本次PCR擴(kuò)增共30個(gè)循環(huán)，時(shí)間共計(jì)1h53min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物，于冰上放置，等待進(jìn)行下一步的電泳檢測。此外，多次實(shí)驗(yàn)嘗試表明冷凍保存后的PCR產(chǎn)物會發(fā)生降解，瓊脂糖凝膠電泳檢測效果不佳。

表2 PCR擴(kuò)增條件(PCR程序設(shè)置) (℃、min)

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測 4.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，電壓120V，電流100mA，電泳20min，凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.2.5 限制性酶切 限制性酶切采取15μl的酶切體系，見表3。加樣順序?yàn)槌兯?0×Buffer→PCR產(chǎn)物→限制性內(nèi)切酶。從-20℃冰柜中取出限制性內(nèi)切酶后要立馬放入事先準(zhǔn)備好的冰盒。將按順序加好試劑的離心管在離心機(jī)上1000rpm離心10s，取出后放入37℃水浴鍋加熱15min后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，取5μl的酶切產(chǎn)物與1μl的10×Loading Buffer混合后加入點(diǎn)樣孔，第一個(gè)孔中加入6μl 2000的Marker作為對照電泳步驟同上述PCR產(chǎn)物的電泳。

表3 酶切反應(yīng)體系 (μl)

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法 通過EXCEL、SPSS.23單因素ANOVA分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析了不同基因型與窩平均產(chǎn)羔數(shù)、初配時(shí)間、初生重、子宮角長的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)只與窩平均產(chǎn)羔數(shù)和初配時(shí)間有顯著影響。卡方值χ2=?[(O-E)2/E]。

2 結(jié)果及分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

通過上述20μl PCR體系以及生工生物公司提供的kiss-1基因的上下游引物，對1101bp的目的片段展開PCR擴(kuò)增，通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，圖一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性明顯，與預(yù)期結(jié)果相符，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 kiss-1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶

2.2 酶切結(jié)果

研究表明，kiss-1基因在296位點(diǎn)發(fā)生了由G→C的突變，由此可以被限制性內(nèi)切酶識別并在特定位點(diǎn)切割。由此預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果為CC、CG、GG三種基因型的條帶。電泳結(jié)果顯示，在本次實(shí)驗(yàn)所選用的26個(gè)濟(jì)寧青山羊樣本中，kiss-1基因存在CC型(突變純合子)、CG型(雜合子)、GG型(野生型)三種基因型，其中CC型片段長度為805+296bp，CG型片段長度為1101+805+296bp。GG型片段長度為1101bp。

圖2 山羊kiss-1G296C位點(diǎn)的PCR-RFLP分析

2.3 基因型頻率和基因頻率

由PCR-RFLP后確定此次試驗(yàn)中的26個(gè)樣本的基因型如下表所示。其中，基因型為CC型的個(gè)體有3個(gè)，基因型為CG型的個(gè)體有7個(gè)，剩余的16個(gè)樣本均未發(fā)生突變，基因型為GG型。計(jì)算可得CC型基因型頻率為11.54%，CG型基因型頻率為26.92%，GG型基因型頻率為61.54%。等位基因頻率：C為25%(p)，G為75%(q)。

2.4 哈代溫伯格平衡

經(jīng)卡方檢驗(yàn)，χ2=2.0646＜χ20.05(1)，P＞0.05差異不明顯，此群體在kiss-1 296位點(diǎn)符合哈代溫伯格平衡定律。

表4 濟(jì)寧青山羊的基因型頻率、基因頻率及卡方

2.5 基因型與窩平均產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

通過使用SPSS.23進(jìn)行單因素方差A(yù)NOVA分析，得如下表結(jié)果，kiss-1該位點(diǎn)對濟(jì)寧青山羊窩平均產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響(P＜0.05)。GG型母羊的窩平均產(chǎn)羔數(shù)比CC型多0.85只(P＜0.05)，GG型與CG型、CG型與CC型之間(P＞0.05)在窩平均產(chǎn)羔數(shù)上的差異不明顯。

表5 不同基因型窩平均產(chǎn)羔數(shù)間的比較 (只)

2.6 基因型與初配時(shí)間的關(guān)系

SPSS.23單因素方差A(yù)NOVA分析結(jié)果顯示，kiss-1基因296位點(diǎn)對初配時(shí)間有顯著影響(P＜0.05)。GG型母羊從出生后到第一次配種的相隔時(shí)間比CG型母羊早58.49天(P＜0.05)，GG型比CC型早77.40d(P＜0.05)，CG型與CC型從出生后到第一次配種相隔時(shí)間之間的差異不顯著(P＞0.05)。

表6 不同基因型初配時(shí)間的比較 (d)

3 討論

3.1 目的基因的PCR擴(kuò)增

在本次實(shí)驗(yàn)中，PCR作為連接DNA和酶切過程關(guān)鍵的一環(huán)，百轉(zhuǎn)曲折。從更換PCR體系到降低退火溫度，筆者嘗試了多種操作，最終也只是做出了特異性較好的條帶，疑似出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。同時(shí)，在多次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，無論是放在-20℃還是4℃，實(shí)驗(yàn)證明，產(chǎn)物都會發(fā)生一定的降解，致使電泳條帶不明顯，因此PCR產(chǎn)物最好當(dāng)天跑完當(dāng)天用。

3.2 kiss-1基因在繁殖上的研究

本研究初步表明，GG型個(gè)體在生產(chǎn)中，第一次配種時(shí)間比其他兩種基因型個(gè)體要早，這對于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐有重要意義。從分子育種角度，及早確定山羊基因型，便可在實(shí)際生產(chǎn)中極大實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早配種、早受益。對于人而言，青春期的啟動與遺傳、營養(yǎng)、環(huán)境密切相關(guān)[11]。同理，動物性成熟的時(shí)間開始的早晚除了受激素的信號通路調(diào)控，也與動物的營養(yǎng)狀況有著密切聯(lián)系。吳琰的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，kiss-1／GPR54系統(tǒng)在山羊初情期的消化系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，但該系統(tǒng)在初生時(shí)胰臟內(nèi)并不表達(dá)，這種基因表達(dá)的時(shí)效性說明kiss-1／GPR54系統(tǒng)通過協(xié)同作用，利用調(diào)節(jié)胰島素的分泌來調(diào)節(jié)動物的營養(yǎng)狀況來保障動物的發(fā)情[12]。張冬梅等人的研究表明kisspeptin、kiss-1r在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中呈低表達(dá)，與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)[13]。丁赫等人的研究表明隨著初情期的啟動，kiss-1基因啟動子區(qū)甲基化水平顯著降低，尤其是在啟動子區(qū)-501位點(diǎn)降低最明顯，并且kiss-1基因mRNA表達(dá)量隨著初情期的啟動顯著升高[14]。師美紅等人的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠卵巢中次級卵泡中kisspeptin表達(dá)減少可能使卵泡對FSH的敏感性降低，使血清中FSH水平升高，因募集大量的初級卵泡，最終使卵母細(xì)胞耗竭[15]。kiss-1基因在小尾寒羊卵泡期下丘腦和松果體的表達(dá)量均顯著高于黃體期，提示其可能在小尾寒羊黃體期到卵泡期發(fā)情狀態(tài)轉(zhuǎn)換中起促進(jìn)作用[16]。上述研究都進(jìn)一步表明，kiss-1基因在動物生長、發(fā)育、繁殖方面有著不可或缺的作用。

綜上所述，基于kiss-1基因?qū)?jì)寧青山羊生長、發(fā)情的調(diào)控，可以初步認(rèn)為，沒有發(fā)生突變的GG型濟(jì)寧青山羊短性成熟期、高產(chǎn)仔數(shù)方面占有優(yōu)勢，這與kiss-1基因促進(jìn)發(fā)情、生長發(fā)育的生物功能相契合。在曹貴鈴等的研究中，選取了198只濟(jì)寧青山羊作為樣本，最后發(fā)現(xiàn)CC型母羊的產(chǎn)羔數(shù)比其他兩種基因型的母羊的產(chǎn)羔數(shù)要多，這與本次研究結(jié)果不符，推測可能的原因是此次選取的樣本含量太少有關(guān)，接下來可以擴(kuò)大樣本容量，進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。

4 小結(jié)

試驗(yàn)結(jié)果表明kiss-1該位點(diǎn)對濟(jì)寧青山羊窩平均產(chǎn)羔數(shù)和初配時(shí)間有顯著影響(P＜0.05)，但由于群體有限，其用于分子標(biāo)記輔助選擇的可靠性還有待于擴(kuò)展樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。