楊修鎮(zhèn) 李有志 徐恩民 張呈軍

（山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所 山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險(xiǎn)評估重點(diǎn)試驗(yàn)室 山東 濟(jì)南 250022）

近年來我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)集約化發(fā)展迅速，動物源性食品中獸藥殘留問題及耐藥菌問題成為社會關(guān)注的焦點(diǎn)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《獸用抗菌藥使用減量化行動試點(diǎn)工作方案(2018-2021年)》，開展獸用抗菌藥物減量行動。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194號[1]規(guī)定自2020年1月1日起，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種，自2020年7月1日起飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥除外)的商品飼料。全價配合飼料是養(yǎng)殖場最常見的飼料[2]，其添加抗菌藥物情況也比較嚴(yán)重[3]，例如2019年11月21日《問政山東》就曝光了某非法飼料生產(chǎn)企業(yè)在飼料中添加恩諾沙星致使某養(yǎng)殖場的雞蛋大批量被檢出恩諾沙星殘留的事件。微生物管碟法[4]是利用抗菌藥物在攤布特定實(shí)驗(yàn)菌的固體培養(yǎng)基內(nèi)呈球面形擴(kuò)散，抑制實(shí)驗(yàn)菌的繁殖呈現(xiàn)出透明的抑菌圈的一種方法。全價配合飼料主要成分[5]為能量飼料、蛋白質(zhì)飼料、礦物質(zhì)飼料、維生素、氨基酸及微量元素添加劑，不含具有明顯抗菌作用的物質(zhì)，經(jīng)提取后無法形成抑菌圈，基于此本文對微生物管碟法檢測全價配合飼料中添加抗菌藥物進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與樣品 藤黃微球菌(Micrococcus luteus)由中國食品藥品檢定研究院提供，菌號為CVCC1600；全價配合飼料，購自山東六和飼料股份有限公司，包括豬配合飼料、雞配合飼料、鴨配合飼料。

1.1.2 抗菌藥物對照品或標(biāo)準(zhǔn)品與試劑 對照品或標(biāo)準(zhǔn)品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，主要包括氟喹諾酮類對照品：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、達(dá)氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星；四環(huán)素類對照品：土霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、金霉素；β內(nèi)酰胺類對照品：阿莫西林、氨芐西林；氨基糖苷類標(biāo)準(zhǔn)品：慶大霉素、安普霉素、卡那霉素、新霉素、鏈霉素、大觀霉素；大環(huán)內(nèi)酯類標(biāo)準(zhǔn)品：紅霉素、泰樂菌素、替米考星；磺胺類對照品：磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺喹噁啉；林可霉素對照品；氟苯尼考對照品；硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品；抗生素檢定培養(yǎng)基ⅠⅠ(pH6.5～6.6)、滅菌緩沖液(pH 6.0)購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；水為一級水，其余試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備 AE-240電子天平(Mettler公司)、PB－10酸度計(jì)(北京賽多里斯儀器系統(tǒng)有限公司)、KQ3000超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)、CF16RXⅠⅠ離心機(jī)(日立工業(yè)株式會社)、GNP-9160恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)、ZY-300Ⅳ抑菌圈自動測量分析儀(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 取研細(xì)后的全價配合飼料2g，精密稱定，置50ml離心管中，加滅菌緩沖液20ml，超聲提取5min(40KHz)，8000rpm離心5min，取上清液，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制 取各抗菌藥物對照品或標(biāo)準(zhǔn)品10mg，精密稱定，置100ml容量瓶中，加滅菌緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置10ml容量瓶中，加滅菌緩沖液至刻度，搖勻，即得。

1.2.3 藤黃微球菌懸液的制備[6]取藤黃微球菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在26～27℃培養(yǎng)24h，用0.9%滅菌氯化鈉溶液5ml將菌苔洗下，備用。

1.2.4 管碟的制備[6]取直徑約90mm高16～17mm的平底碟，注入滅菌后融化的培養(yǎng)基ⅠⅠ(pH6.5～6.6)20ml，使在碟底內(nèi)均勻攤布，放在水平臺上使凝固，作為底層。另取滅菌后融化的培養(yǎng)基適量，放冷至48～50℃，加入藤黃微球菌懸液適量，搖勻，每碟加入5ml，使在底層上均勻攤布，作為菌層。放置在水平臺上冷卻后，在碟中心位置放置一不銹鋼小管(內(nèi)徑為6.0±0.1mm，高為10±0.1mm，外徑為7.8±0.1mm)，用陶瓦圓蓋覆蓋備用。

1.2.5 菌層菌濃的選擇 取1.3.2中各標(biāo)準(zhǔn)品溶液各290μl加入1.3.4制備的管碟中(每碟僅加一種抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液)，用陶瓦圓蓋覆蓋，置恒溫培養(yǎng)箱中36±1℃培養(yǎng)16h，測量抑菌圈大小，抑菌圈直徑18～20mm時的菌濃為適宜菌濃。

1.2.6 陰性對照試驗(yàn) 取研細(xì)后的全價配合飼料(未添加抗菌藥物)，按照1.2.1制備樣品溶液，吸取290μl加入經(jīng)1.2.4和1.2.5制備的管碟中，用陶瓦圓蓋覆蓋，置恒溫培養(yǎng)箱中36±1℃培養(yǎng)16h，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈。

1.2.7 陽性對照試驗(yàn) 取全價配合飼料，按100mg/kg分別加入各抗菌藥物，混勻，研細(xì)，按照1.3.1制備樣品溶液，吸取290μl加入經(jīng)1.2.4和1.2.5制備的管碟中，用陶瓦圓蓋覆蓋，置恒溫培養(yǎng)箱中36±1℃培養(yǎng)16h，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈。

1.2.8 檢出限 取全價配合飼料，分別加入一定量的各抗菌藥物，混勻，研細(xì)，按照1.2.1制備樣品溶液，吸取290μl加入經(jīng)1.2.4和1.2.5制備的管碟中，用陶瓦圓蓋覆蓋，置恒溫培養(yǎng)箱中36±1℃培養(yǎng)16h，測量抑菌圈大小。出現(xiàn)明顯抑菌圈(≥鋼管外徑3mm，即抑菌圈直接≥10.8mm)時的各抗菌藥物加入量為檢出限。

2 結(jié)果

2.1 菌層菌濃的選擇

按1.3.5的方法反復(fù)試驗(yàn)，各抗菌藥物的適宜菌濃見表1。

2.2 陰性對照試驗(yàn)和陽性對照試驗(yàn)

各全價配合飼料提取液均未出現(xiàn)抑菌圈，按100mg/kg加入各抗菌藥物后均出現(xiàn)直徑18～20mm的抑菌圈。

表1 各抗菌藥物適宜的藤黃微球菌濃度(每100ml滅菌培養(yǎng)基加入菌懸浮液體積) (ml)

2.3 檢出限

全價配合飼料添加抗菌藥物的檢出限見表2。

表2 全價配合飼料添加抗菌藥物的檢出限 (mg/kg)

3 討論與小結(jié)

（1）飼料中添加抗菌藥物的檢測方法多為高效液相色譜法和高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[7]，高效液相色譜法大多采用保留時間和紫外光譜匹配定性，高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法采用保留時間和兩對離子的相對豐度比定性，兩者相比較高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜定性更為準(zhǔn)確，但無論是高效液相色譜法還是高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法都是一種定向篩查方法，需要借助昂貴的儀器。目前對全價配合飼料中添加抗菌藥物關(guān)注度較高的除了主管部門和相關(guān)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)外還有養(yǎng)殖企業(yè)，養(yǎng)殖企業(yè)在不知情的情況下使用帶有抗菌物質(zhì)的飼料，會致使畜禽產(chǎn)品獸藥殘留超標(biāo)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并會加速耐藥菌株的產(chǎn)生，導(dǎo)致動物機(jī)體免疫力下降，誘發(fā)各種疾病的產(chǎn)生與流行[8]。（2）菌種選擇時考察了對常見抗菌藥物敏感的枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、大腸埃希菌，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)藤黃微球菌對各抗菌物質(zhì)響應(yīng)較好，菌濃容易掌控，不受全價配合飼料提取液影響，因此選擇藤黃微球菌作為檢驗(yàn)用菌種。（3）全價配合飼料為營養(yǎng)成分，不具有抗菌作用，這是與抗菌藥物的最大區(qū)別，微生物管碟法可以簡單有效的篩查全價配合飼料中是否有添加抗菌藥物。盡管該方法無法確定被添加物是何種藥物，無法對其精確定量，但養(yǎng)殖企業(yè)關(guān)心的往往不是這些。養(yǎng)殖企業(yè)缺少相關(guān)精密大型儀器設(shè)備，需要用最簡單的方法確定全價配合飼料中是否添加抗菌藥物。本試驗(yàn)建立的全價配合飼料中添加抗菌藥物檢查方法簡便、快速、無需大型精密儀器，適用于高通量篩查，滿足基層養(yǎng)殖企業(yè)需求。