陳 峰 沈 振 楊國麗 黨安坤 蘭鄒然

（①山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 山東 濟(jì)南 250022 ②山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 山東濟(jì)南 ③遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 遼寧 沈陽）

豚鼠又被稱為荷蘭豬、天竺鼠等，屬哺乳動(dòng)物綱-嚙齒目-豚鼠科-豚鼠屬。Hartley豚鼠是人工馴化后的英國種豚鼠，因其短毛、白化等優(yōu)點(diǎn)被實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。我國各實(shí)驗(yàn)、檢測單位所使用的試驗(yàn)用豚鼠基本上以Hartley豚鼠為主[5]。豚鼠體型勻稱，個(gè)頭嬌小，隨著生物制品產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和更加嚴(yán)格的產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)要求，以及動(dòng)物試驗(yàn)周期性、倫理性等方面的優(yōu)點(diǎn)，使得hartley豚鼠的使用量逐年增多，豚鼠在生物醫(yī)學(xué)研究中的使用量成為大鼠、小鼠、家兔之后，位居第四位的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[3]。其中Hartley豚鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的重要一員，不僅是常規(guī)藥品檢驗(yàn)、生物制品檢驗(yàn)、GLP(Good Laboratory Practice)實(shí)驗(yàn)室中相關(guān)試驗(yàn)所需要的，更是許多科研項(xiàng)目所必備的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。

鏈球菌種類眾多，在自然界分布極為廣泛，有些是非致病菌，構(gòu)成任何動(dòng)物的正常菌群，有些可致人或動(dòng)物的各種化膿性疾病、肺炎、乳腺炎、敗血癥等[7]。鏈球菌呈圓形或卵圓形，直徑小于2.0μm，常排列成鏈狀或成雙，也有單個(gè)出現(xiàn)的，屬于革蘭氏陽性菌。致病性的鏈球菌對(duì)營養(yǎng)要求較高，普通培養(yǎng)基生長不良，加血液或血清的培養(yǎng)基生長良好。鏈球菌可以根據(jù)在血瓊脂平板上的溶血現(xiàn)象分為α、β、γ三類，其中β型溶血鏈球菌致病力最強(qiáng)，常引起人及動(dòng)物各種疾病[7]。馬鏈球菌獸疫亞種(舊稱獸疫鏈球菌)在自然界分布廣泛，有家畜的地方皆有存在，在血平板是上產(chǎn)生明顯的β溶血[7]。2017年4月，山東省濟(jì)南市某豚鼠飼養(yǎng)場發(fā)生以呼吸系統(tǒng)為主要病癥的疾病。通過對(duì)患病豚鼠病原采集、分離鑒定、毒力試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)等，確定病原微生物為鏈球菌所致。通過對(duì)本病原菌進(jìn)行分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，為臨床的科學(xué)防治提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品 2017年4月，山東省濟(jì)南市某豚鼠飼養(yǎng)場發(fā)生以呼吸系統(tǒng)為主要癥狀的疾病，并伴隨咳嗽、氣喘、膿性鼻涕直至死亡。疾病發(fā)生后，前往養(yǎng)殖場采集病死、瀕死豚鼠樣品10份。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 18～22gⅠCR小鼠，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。250g至300gHartley豚鼠購自濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。血瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(TSA)購自北京陸橋。膠回收試劑盒、PCRmix、DS2000DNA Marker購自上海生工。藥敏試紙、微生物鑒定所用GN細(xì)菌鑒定卡購自其生產(chǎn)商銷售代理。

1.3 患病動(dòng)物臨床癥狀與診斷 通過問診、視診、觸診，記錄臨床癥狀。對(duì)患病死亡動(dòng)物進(jìn)行解剖檢查，記錄病變臟器癥狀。肺臟、肝臟、腎臟等臟器的無菌切面直接觸片，用瑞氏染色后鏡檢。

1.4 細(xì)菌的分離純化培養(yǎng) 用無菌接種環(huán)穿破臟器表面沾取組織后，在血瓊脂培養(yǎng)基平皿上劃線。經(jīng)過恒溫水浴箱37℃、24h培養(yǎng)。對(duì)菌落進(jìn)行觀察，把菌落形態(tài)特征相近類似的進(jìn)行劃線培養(yǎng)。反復(fù)多次。選取單個(gè)菌落接種血瓊脂培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)。

1.5 細(xì)菌的生化特性檢查 應(yīng)用VETEK 2 compact全自動(dòng)微生物分析儀，使用GN細(xì)菌鑒定卡檢測。

1.6 16SrRNA基因序列測定與分析 以分離純化后的菌液為DNA模板，選取16srdna基因擴(kuò)增引物(7F1540R：5"-CAGAGTTTGATCCTGGCTAGGA GGTGATCCAGCCGCA-3"，27F1492R：5"-AGTT TGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGAC TT-3"，PCR長度1500bp左右)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR循環(huán)條件：94℃4min，94℃45sec、55℃ 45sec、72℃1min、30cycle，72℃10min?；厥誴cr產(chǎn)物，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定，利用blast進(jìn)行同源性比對(duì)，采用mega7的neighbor-joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[1]。

1.7 藥敏試驗(yàn) 采用kirby-bauer瓊脂擴(kuò)散法，通過測量抑菌圈的直徑，重復(fù)3次，取平均值。依據(jù)CLSⅠ的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，判定分離菌株對(duì)藥物的敏感性。

1.8 分離菌毒力試驗(yàn) 首先配置菌液，前一天接種TSA培養(yǎng)基后，37℃培養(yǎng)24h。用移液管吸取5ml生理鹽水放入培養(yǎng)基中，用無菌接種環(huán)剝落培養(yǎng)基上的菌落，制備成菌懸液移入無菌試管中，菌液濃度調(diào)制3個(gè)10倍梯度(6.34×107CUF/ml，6.34×106CUF/ml，6.34×105CUF/ml)，調(diào)制后密封管口備用。選取20只18g-20gⅠcr小鼠和5只280g-320g豚鼠。Ⅰcr小鼠分為4組，每組各5只動(dòng)物。其中1～3組每組對(duì)應(yīng)一個(gè)菌液濃度分別給藥，每只ⅠCR小鼠注射0.2ml菌液。第4組每只icr小鼠注射0.2ml生理鹽水。豚鼠分為2組，其中3只豚鼠腹腔注射濃度為6.34×106CUF/ml的0.5ml菌液，另外2只豚鼠腹腔注射0.5ml生理鹽水。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀 精神沉郁，食欲下降，飲水減少，有的則食欲廢絕無飲水，體型消瘦，毛焦，弓身蜷縮，腹式呼吸，鼻頭潮紅有粘液，有的為黃色膿狀物，少數(shù)豚鼠頸部腫大。瀕死及死亡動(dòng)物常口鼻出血。

2.2 剖檢癥狀 剪開腹腔有嚴(yán)重的腹腔出血，肝臟有綠豆大小梗死灶，腎臟色白，肺臟大面積實(shí)質(zhì)性肉變，心臟多處有針尖樣出血，頜下淋巴結(jié)淤血腫脹，淋巴結(jié)斷面呈紅白相間大理石樣，氣管有淤血和粘稠狀物。

2.3 涂片鏡檢 用瑞氏染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)，有呈卵圓形，無兩級(jí)著色，大部分呈單個(gè)存在，少量呈鍛煉狀結(jié)構(gòu)的球菌。

2.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 觀察發(fā)現(xiàn)血平皿長出透明點(diǎn)狀菌落，菌落邊緣光滑，有凸起，色澤呈黃白色。菌落周圍出現(xiàn)完全溶血的β溶血環(huán)(見圖1～2)。

圖1 分離菌株

圖2 分離菌株呈β溶血環(huán)

2.5 分離菌的生化特性鑒定 應(yīng)用VETEK 2 compact全自動(dòng)微生物分析儀，使用GN細(xì)菌鑒定卡檢測。得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)報(bào)告顯示與豬鏈球菌Ⅰ型(Streptococcus suis Ⅰ)有93%幾率相似。相似幾率不是很高，這有可能是細(xì)菌鑒定卡數(shù)據(jù)庫不全面導(dǎo)致的。但通過生化特征指標(biāo)可以判定該分離菌為鏈球菌。這與分離培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)的β溶血環(huán)等特征相符。 檢測結(jié)果見表1。

表1 分離株的生理生化特征

2.6 分離菌16SrRNA基因序列測定與分析 將分離菌株16SrRNA PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序和分析，發(fā)現(xiàn)所獲取的DNA片段長度為1507bp。分離菌株與馬鏈球菌獸疫亞種(CP002904.1)高達(dá)99%的同源性。將該菌基因序列在BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，利用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，該分離菌與馬鏈球菌獸疫亞種CP002904.1、FM204884.1、CP021972.1、FM204883.1株的遺傳關(guān)系最為接近，處于同一分支上。結(jié)合分離菌株生化特征，則判定分離菌株為馬鏈球菌獸疫亞種，并將其命名為sd2017fc。進(jìn)化樹情況見圖3。

2.7 分離菌藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)選取了臨床常用抗生素，作為測試對(duì)象。選取的抗生素有：頭孢曲松鈉、青霉素、阿莫西林、頭孢呋辛鈉、哌拉西林、氨芐青霉素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶、頭孢噻肟、磺胺甲基異唑、慶大霉素。結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)頭孢曲松鈉、青霉素、阿莫西林、氨芐青霉素、哌拉西林環(huán)丙沙星等最為敏感。對(duì)阿奇霉素、慶大霉素有一定的耐藥性。

2.8 分離菌毒力試驗(yàn) 小鼠毒力試驗(yàn)按照三種菌液濃度分別對(duì)應(yīng)注射，并在給藥后的3、5、8、24、36、48h時(shí)間點(diǎn)給與觀察。觀察發(fā)現(xiàn)6.34×107CUF/ml組在注射菌液后小鼠未表現(xiàn)明顯癥狀就出現(xiàn)死亡，并在8h觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠全部死亡。6.34×106CUF/ml組注射后5h觀察發(fā)現(xiàn)有2只小鼠出現(xiàn)呼吸困難等癥狀，在24h觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)僅存的兩只小鼠也出現(xiàn)了呼吸困難的癥狀，并在48h觀察發(fā)現(xiàn)小鼠全部死亡。6.34×105CUF/ml組在5h觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)有1只小鼠出現(xiàn)呼吸困難癥狀，在24h觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)死亡兩只小鼠，1只小鼠存在呼吸困難，在48h觀察時(shí)僅有1只小鼠存活，但已出現(xiàn)呼吸困難處于瀕死狀態(tài)。生理鹽水組未發(fā)現(xiàn)異常癥狀和死亡(見表2)。豚鼠毒力試驗(yàn)按照6.34×106CUF/ml菌液濃度注射3只豚鼠，另外兩只注射生理鹽水。注射菌液的3只豚鼠均出現(xiàn)流涕、咳嗽等癥狀，24h觀察時(shí)全部死亡。注射生理鹽水的兩只豚鼠未出現(xiàn)明顯癥狀，未死亡。對(duì)死亡的小鼠和豚鼠進(jìn)行解刨，并在肺臟再次分離到細(xì)菌，通過鏡檢和生化特性鑒定與注射菌液為同一種細(xì)菌。

表2 分離菌小鼠毒力試驗(yàn)(給藥后存活數(shù)) (只)

3 討論

（1）結(jié)合臨床癥狀以及利用培養(yǎng)基分離細(xì)菌進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，可以初步判斷致病細(xì)菌種類。對(duì)于臨床的及時(shí)診療有很重要的參考意義。利用VETEK2compact全自動(dòng)微生物分析儀，可以快速的找出最為相似的細(xì)菌進(jìn)行判定，但本次鑒定中受到細(xì)菌數(shù)據(jù)庫種類和系統(tǒng)授權(quán)等原因，只能找到數(shù)據(jù)庫中最為相似的細(xì)菌進(jìn)行判定，導(dǎo)出結(jié)果具有局限性。但是其生化特性指標(biāo)是重要的參照依據(jù)，可以通過這些指標(biāo)進(jìn)一步查詢和判定。依據(jù)基因數(shù)據(jù)庫的優(yōu)勢，是判定分離菌株為何種細(xì)菌最為準(zhǔn)確有效的方式，但周期較長，判定速度相對(duì)較慢。通過毒力試驗(yàn)，分離菌株菌液注射小鼠和豚鼠后均引起了臨床癥狀和死亡，通過再次分離得到的細(xì)菌與注射的分離菌株相同，驗(yàn)證了其分離菌株毒力，也證明了分離菌株就是該病致病菌。結(jié)合藥敏試驗(yàn)，在藥物選擇上，藥敏試驗(yàn)結(jié)果與鐘英梅等[6]所報(bào)道的對(duì)阿莫西林、環(huán)丙沙星、氨芐青霉素敏感，而對(duì)慶大霉素等敏感度較低等內(nèi)容相似。最終選擇阿莫西林進(jìn)行治療，死亡量明顯下降，疫病得到了有效控制。（2）鏈球菌是人畜共患菌，對(duì)動(dòng)物和人均有致病性。本次通過患病豚鼠分離得到的馬鏈球菌獸疫亞種細(xì)菌，這與唐海波等[1]報(bào)道的在黑豚鼠身上分離得到的鏈球菌為一類，但臨床癥狀上未發(fā)現(xiàn)眼睛發(fā)白甚至失明等有區(qū)別。患病豚鼠體型消瘦，毛焦，弓身蜷縮，常有口鼻出血的癥狀這些與張鈺等[8]、付少才等[9]報(bào)道的非常相似，但只有少量患病動(dòng)物表現(xiàn)頜下淋巴結(jié)腫大與其報(bào)道不同。也有可能是急性病例未能產(chǎn)生頜下淋巴結(jié)腫脹癥狀只表現(xiàn)出其他癥狀后就死亡的原因，所以本次病例中少見脖子腫大癥狀。綜上所述豚鼠由鏈球菌引起的肺炎，多以精神沉郁、鼻腔膿性分必物、頜下淋巴結(jié)腫脹、急性者多口鼻出血為主要臨床癥狀。（3）Hartley豚鼠引起生理學(xué)特點(diǎn)，對(duì)于環(huán)境要求較高。對(duì)日溫差等條件的要求較為苛刻。尤其是春季和秋季，冷熱交替現(xiàn)象較多，易導(dǎo)致豚鼠機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致免疫力降低，從而感染鏈球菌導(dǎo)致患病[4]。從這點(diǎn)上出發(fā)，應(yīng)從內(nèi)、外兩方面來考慮解決問題。一方面是外部環(huán)境給予充分支撐，保障其飼養(yǎng)生產(chǎn)環(huán)境可靠，飼養(yǎng)用具消毒清潔要做到位等[2]。另一方面，可以從提升其自身免疫力入手，例因其不能自身合成維生素C，所以在飼養(yǎng)過程中應(yīng)多關(guān)注豚鼠維生素C的攝取量，保障其日常所需[10]。使得動(dòng)物機(jī)體有一定的抵抗力，不易致病。