石 嬌，吳東明，李 靜，許 穎

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗科(成都610500)

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于體內(nèi)尿酸代謝異常引起的高尿酸癥，過多的尿酸鈉(monosodium urate, MSU)晶體沉積于關(guān)節(jié)腔、滑膜、軟骨等關(guān)節(jié)組織而導(dǎo)致炎性病變[1]。隨著人們生活質(zhì)量的提高，生活方式和飲食習(xí)慣發(fā)生變化，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率和患病率在全球范圍內(nèi)快速增長且有年輕化趨勢，目前我國痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的患病率約為1%～3%[2-3]。

近幾年研究[4]發(fā)現(xiàn)，細胞焦亡在心血管、內(nèi)分泌、感染性等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中均有參與。細胞焦亡是一種有別于細胞凋亡和細胞壞死的炎癥性程序性死亡模式，細胞焦亡過程中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerizatiin domain, NOD)樣受體(NOD-like receptor, NLR)炎性小體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)等蛋白質(zhì)和復(fù)合物發(fā)揮著重要作用[5]。目前，細胞焦亡是否參與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制尚無研究，因此本研究擬通過檢測急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者血清中白細胞介素1β(Interleuin-1beta, IL-1β)和PBMCs(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中IL-1β及caspase-1的表達水平，探討細胞焦亡與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為疾病的診斷、治療及防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年8月至2019年3月于成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診就診的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者40例，正常對照組選取體檢中心實驗指標(biāo)正常的健康體檢人群40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者均符合1977年美國風(fēng)濕協(xié)會(American college of rheumatology, ACR)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的分類標(biāo)準(zhǔn)；發(fā)病后未服用糖皮質(zhì)激素、秋水仙堿等藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心腦血管疾病、腎臟系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、感染性及自身免疫相關(guān)疾病。40例急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者(acute gout, AG)和健康對照者(healthy controls, HC)分別為AG組、HC組。

1.2 材料

IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自上海生物工程有限公司；樣本密度分離液購自天津灝洋華科生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自江蘇長星醫(yī)療科技有限公司；MD-AIM-V細胞培養(yǎng)基購自美德太平洋(天津)生物科技股份有限公司；IL-1β抗體、caspase-1購自Abcom公司；生化試劑購自邁克生物有限公司；其余試劑、耗材購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 標(biāo)本采集及處理

分別采集AG組和HC組肝素抗凝全血5 mL，用樣本密度分離液分離全血中的PBMCs，將分離得到的PBMCs中加入MD-AIM-V細胞培養(yǎng)基300 μL吹打混勻后備用。采用全自動血球分析儀(希森美康XS-500i)進行 PBMCs的純度驗證。采用免疫印跡法檢測PBMCs中IL-1β、caspase-1的蛋白水平：對收集備用的PBMCs于4 ℃下以12 000 r/min離 心10 min后，通過調(diào)整蛋白濃度至6 mg/L后進行蛋白表達檢測，記錄并進行灰度值分析，將目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)灰度值比較，作為目的蛋白的相對表達量。

同時分別采集AG組和HC組靜脈血4 mL，3 500 r/min離心5 min后，分離血清備用。采用全自動生化分析儀(日立式7600型)檢測血清中尿酸(uric acid, UA)、肌酐(creatinine, CREA)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alaninetransaminase, ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase, AST)、總蛋白(total protein, TP)、白蛋白(albumin, ALB)、前白蛋白(prealbumin, PA)的含量。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中IL-1β表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PBMCs的驗證結(jié)果

PBMCs是外周血單個核細胞，其包括淋巴細胞(lymphocyte, LYMP)和單核細胞(monocyte, MONO)。AG組和HC組全血分離的細胞主要為PBMCs，純度達(94.91±2.40)%(表1、圖1)。

表1 AG組與HC組 PBMCs驗證結(jié)果

2.2 兩組PBMCs中IL-1β和caspase-1的免疫印跡法分析結(jié)果

兩組PBMCs中IL-1β和caspase-1的免疫印跡法分析結(jié)果提示，AG組較HC組IL-1β和caspase-1表達水平增強(圖2)。

2.3 兩組UA、CREA、BUN、PA、ALT、AST、TP、ALB的檢測結(jié)果

AG組與HC組年齡、TP和ALB差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，AST、ALT差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，UA、CREA、BUN、PA差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表2)。

表2 AG組與HC 組一般臨床資料

2.4 AG組與HC組血清中IL-1β檢測結(jié)果

GA組的IL-1β的表達比HC組明顯升高，GA組IL-1β表達量為(1.08±0.79) μg/L，HC組IL-1β表達量為(0.30±0.08)μg/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.036,P<0.001)(圖3)。

2.5 AG組UA、BUN、CREA與IL-1β相關(guān)性比較

血清UA與IL-1β呈正相關(guān)性(r=0.501,P=0.004)，血清BUN、CREA與IL-1β無相關(guān)性(圖4)。

3 討論

近年來，由于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎對組織器官的嚴(yán)重損害以及多樣化的并發(fā)癥使其成為困擾人類健康的一大難題。目前痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查[3]。實驗室檢測指標(biāo)主要有血清中尿酸含量檢測和關(guān)節(jié)炎發(fā)作時關(guān)節(jié)液微生物培養(yǎng)情況，但關(guān)節(jié)液的采集比較困難且微生物培養(yǎng)周期用時長，不利于作為常規(guī)檢查開展，因此需尋找更多有效的實驗室檢測指標(biāo)用于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的早期診斷及鑒別診斷，以及為監(jiān)測患者治療期間的變化提供有效的幫助。在本研究中，除UA在AG組較HC組升高，還可見BUN、CREA、PA、ALT、AST等指標(biāo)呈增加趨勢，這是因為在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中，體內(nèi)尿酸的生成增多，而腎臟排泄減少，加重體內(nèi)腎臟和肝臟代謝負擔(dān)，從而出現(xiàn)肝功能和腎功能的指標(biāo)異常變化。血清中BUN、CREA、PA、ALT、AST的含量變化可用作評估急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的伴隨癥狀。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病理生理不僅與高尿酸血癥有關(guān)，還涉及炎癥小體的激活。炎癥反應(yīng)是參與介導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的一個重要過程，本研究中可見，血清中IL-1β在AG組的表達較HC組有明顯升高，Ma等[5-6]也證實痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)與炎性因子IL-1β的表達增加有關(guān)。IL-1β屬于IL-1的分泌型，是血液循環(huán)中主要存在的形式，也是MSU晶體誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，IL-1β參與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎癥的發(fā)生發(fā)展，可作為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作指標(biāo)。本研究進一步發(fā)現(xiàn)PBMCs中IL-1β和caspase-1蛋白水平的表達，AG組IL-1β和caspase-1蛋白水平明顯高于HC組。caspase-1蛋白水平的表達增加與核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NLR family, Pyrin domain containing 3, NLRP3)炎癥小體介導(dǎo)的細胞焦亡信號通路有關(guān)[7-9]。細胞焦亡經(jīng)典激活途徑主要表現(xiàn)為caspase-1的活化，NLRP3炎癥小體激活，導(dǎo)致炎性因子的釋放,從而誘發(fā)級聯(lián)放大的炎性反應(yīng)，對機體的免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用[10-11]。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程是由于關(guān)節(jié)腔內(nèi)尿酸鹽濃度急劇增加，導(dǎo)致MSU晶體的不斷形成，MSU晶體作為內(nèi)源性損傷相關(guān)因子激活NLRP3炎癥小體組裝，活化的NLRP3炎性小體剪切caspase-1前體形成成熟的caspase-1，caspase-1繼而切割I(lǐng)L-1β前體，促進IL-1β的成熟及分泌，最終導(dǎo)致痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎性反應(yīng)[12]。房樹標(biāo)等[12]研究采用IL-1β的抑制劑后發(fā)現(xiàn)，caspase-1表達減少，NLRP3炎性小體的信號通路降低，進一步證實了IL-1β的產(chǎn)生與caspase-1介導(dǎo)的NLRP3信號通路有關(guān)。

綜上所述，IL-1β和caspase-1介導(dǎo)的細胞焦亡在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。但caspase-1介導(dǎo)的細胞焦亡過程中除有IL-1β釋放，還有白細胞介素18(Interleuin-18, IL-18)等炎性因子釋放，后續(xù)的研究中將繼續(xù)檢測更多的焦亡指標(biāo)，進一步驗證細胞焦亡在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的作用。