李建偉 田文靜 劉 民

(滄州市中心醫(yī)院泌尿外二科，滄州 061001)

膀胱癌又稱膀胱尿路上皮癌，是發(fā)生在膀胱黏膜上常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，也是全球第九大常見腫瘤[1]。目前治療膀胱癌的主要方式是手術(shù)聯(lián)合放射治療，但由于膀胱癌患者對放療不敏感導(dǎo)致患者預(yù)后不良[2]。因此，有效提高膀胱癌患者的放射敏感性變得十分迫切。c-Met是肝細(xì)胞生長因子受體，在多數(shù)惡性腫瘤中呈高表達(dá)[3-5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，c-Met的高表達(dá)與腫瘤患者預(yù)后不良密切相關(guān)[6]。目前，c-Met在調(diào)控腫瘤細(xì)胞放射敏感性的研究備受人們關(guān)注[7,8]。近期研究發(fā)現(xiàn)，c-Met在膀胱癌組織亦呈高表達(dá)，可能與膀胱癌的臨床分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[9]。但c-Met是否參與膀胱癌患者放射敏感性的研究目前尚未見報道。因此本實(shí)驗(yàn)通過小干擾RNA技術(shù)靶向沉默c-Met基因表達(dá)，旨在觀察c-Met siRNA對膀胱癌T24細(xì)胞放射敏感性的影響，并探討其作用機(jī)制，以期為膀胱癌的放射治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人膀胱癌T24細(xì)胞(武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心)；RPIM1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國HyClone公司)；噻唑藍(lán)(Methylthiazolyl-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT)試劑(美國Invitrogen公司)；胰蛋白酶(杭州四季青生物工程材料有限公司)；Trizol試劑、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；特異性c-Met siRNA1、c-Met siRNA2及非特異性c-Met siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；Cleaved Caspase-3抗體、Bax抗體、PI3K抗體和p-AKT抗體及二抗(美國CST公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京康為試劑有限公司)；SYBR premix Ex Taq PCR Kit熒光定量PCR檢測試劑盒(日本TaKaRa公司)；細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；Annexin-Ⅴ/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人膀胱癌T24細(xì)胞培養(yǎng)條件為：含10%胎牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基(內(nèi)含有100 U/ml青霉素和鏈霉素)，5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的T24細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞生長匯合至40%左右時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，以轉(zhuǎn)染特異性c-Met siRNA1的T24細(xì)胞為si-c-Met1組，以轉(zhuǎn)染特異性c-Met siRNA2的T24細(xì)胞為si-c-Met2組，以轉(zhuǎn)染非特異性c-Met siRNA的T24細(xì)胞為NC組，同時設(shè)置空白對照組(Blank組)。轉(zhuǎn)染后將各組細(xì)胞置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2qRT-PCR檢測各組T24細(xì)胞中c-Met基因mRNA表達(dá)情況 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組T24細(xì)胞，Trizol法提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，以SYBR premix Ex Taq PCR Kit熒光定量PCR檢測試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，采用20 μl反應(yīng)體系：cDNA 1 μl，上下游引物各0.8 μl，2×SYBR premix Ex Taq PCR Mix 10 μl，由ddH2O補(bǔ)齊20 μl。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，95℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT法檢測各組T24細(xì)胞中c-Met mRNA相對表達(dá)量。

1.2.3Western blot檢測各組T24細(xì)胞中c-Met蛋白表達(dá)情況 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組T24細(xì)胞，加入蛋白裂解液置冰上提取細(xì)胞中總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒對蛋白定量測定，取等量變性蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，置5%脫脂奶粉中封閉2 h，加入一抗(c-Met一抗稀釋比為1∶1 000)雜交，4℃雜交過夜，TBST洗膜3次，加入二抗(二抗稀釋比為1∶3 000)雜交，室溫雜交2 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光，以GAPDH標(biāo)定，使用Image J軟件分析圖像，計(jì)算各組T24細(xì)胞中c-Met蛋白相對表達(dá)量。

1.2.4MTT檢測各組T24細(xì)胞增殖情況 各組T24細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24、48、72 h，分別向細(xì)胞中加入20 μl MTT溶液，37℃孵育4 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，取上清，再向細(xì)胞中添加100 μl二甲基亞砜，振蕩反應(yīng)10 min，沉淀完全溶解后，使用全自動酶標(biāo)儀測定細(xì)胞在450 nm波長處吸光度值(A值)。

1.2.5克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測T24細(xì)胞克隆形成能力 各組T24細(xì)胞以胰蛋白酶消化成單個細(xì)胞，計(jì)數(shù)后稀釋備用。在6孔板中種植200個細(xì)胞，置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，室溫下給予6 MeV電子線照射，照射劑量分別為0、2、4、6、8 Gy，照射后繼續(xù)培養(yǎng)14 d，以甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色30 min，洗去染液后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個細(xì)胞克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?%)=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，存活分?jǐn)?shù)(SF)=照射克隆形成率/對照克隆形成率，采用線性二次模型計(jì)算發(fā)射生物學(xué)參數(shù)，并擬合劑量存活曲線，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取均值。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測照射后各組T24細(xì)胞凋亡情況 分別收集經(jīng)0 Gy和4 Gy照射后的各組T24細(xì)胞，用胰蛋白酶消化成單個細(xì)胞，收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，以Binding Buffer重懸細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中依次加入Annexin-Ⅴ和PI各5 μl，輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min，立即上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7Western blot檢測照射后各組T24細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bax、PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)情況 收集經(jīng)4 Gy照射后的各組T24細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，其中Cleaved Caspase-3一抗稀釋比為1∶800，Bax一抗稀釋比為1∶800，PI3K一抗稀釋比為1∶1 000，p-AKT一抗稀釋比為1∶1 000，其余步驟同1.2.3。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染特異性c-Met siRNA對膀胱癌T24細(xì)胞中c-Met表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染c-Met siRNA1和c-Met siRNA2的T24細(xì)胞中c-Met mRNA相對表達(dá)量較Blank組均有不同程度的降低(P<0.05)，si-c-Met2組下降尤為明顯，NC組和Blank組間c-Met mRNA相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western blot檢測同樣顯示，與Blank組比，si-c-Met1組和si-c-Met2組c-Met蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05)，si-c-Met2組c-Met蛋白表達(dá)水平下調(diào)較明顯，而NC組和Blank組相比，c-Met蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1和表1。si-c-Met2對膀胱癌T24細(xì)胞中c-Met的靶向沉默作用更顯著，因此選擇si-c-Met2進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2沉默c-Met基因?qū)24細(xì)胞增殖能力的影響 MTT法檢測Blank組、NC組和si-c-Met2組T24細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48、72 h的A值，結(jié)果見表2所示，3組間相同時間點(diǎn)的A值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明靶向沉默c-Met基因?qū)Π螂装㏕24細(xì)胞的增殖能力無較大影響。

圖1 Western blot檢測各組膀胱癌T24細(xì)胞中c-Met蛋白表達(dá)情況Fig.1 Western blot analysis of c-Met protein expression in bladder cancer T24 cells

2.3沉默c-Met基因增強(qiáng)T24細(xì)胞對放射的敏感性 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，與Blank組相比，4、6、8、10 Gy劑量照射后si-c-Met2組T24細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯減少(P<0.05)。而Blank組和NC組間細(xì)胞克隆形成數(shù)無明顯改變(P>0.05)。Blank組、NC組和si-c-Met2組D0值分別為：5.91、5.89和3.65，SF2值分別為：0.85、0.84和0.61。與Blank組相比，si-c-Met2組T24細(xì)胞D0值和SF2值均明顯降低，而Blank組和NC組相比，D0值和SF2值均無明顯改變(P>0.05)。以線性二次模型擬合各組T24細(xì)胞劑量存活曲線，見表3和圖2。表明靶向沉默c-Met基因能夠增強(qiáng)膀胱癌T24細(xì)胞的放射敏感性。

2.4沉默c-Met基因提高照射條件下T24細(xì)胞的凋亡率 各組T24細(xì)胞接受0 Gy和4 Gy照射后，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，Blank組、NC組和si-c-Met2組接受0 Gy時細(xì)胞凋亡率分別為：(3.01±1.38)%、(3.22±2.40)%、(8.08±3.83)%，各組細(xì)胞凋亡率比較無顯著差異(P>0.05)。接受4 Gy時細(xì)胞凋亡率分別為：(20.36±2.08)%、 (21.17±2.98)%、 (48.79±6.11)%，si-c-Met2組細(xì)胞凋亡率明顯高于Blank組(P<0.05)，而Blank組和NC組比較差異不顯著(P>0.05)。提示放射時靶向沉默c-Met2基因可促進(jìn)T24細(xì)胞凋亡。見圖3和表4。

Groupsc-Met mRNAc-Met proteinBlank1.00±0.100.24±0.03NC0.94±0.090.21±0.02si-c-Met10.52±0.051)0.11±0.011)si-c-Met20.23±0.021)0.04±0.011)F75.78667.733P0.0000.000

Note:Compared with the blank group,1)P<0.05.

GroupsA value(λ=450)24 h48 h72 hBlank0.45±0.040.64±0.060.81±0.08NC0.43±0.040.62±0.050.80±0.08si-c-Met20.42±0.040.59±0.060.76±0.07F0.4380.5880.356P0.6650.5850.714

Note:Compared with the blank group,1)P<0.05.

圖3 流式細(xì)胞儀檢測各組T24細(xì)胞凋亡率Fig.3 Flow cytometry to detect apoptosis rate of T24 cells in each group

Groups0 Gy4 GyBlank3.01±1.3820.36±2.08NC3.22±2.4021.17±2.98si-c-Met28.08±3.8348.79±6.111)F3.31646.651P0.1070.000

Note:Compared with the blank group,1)P<0.05.

圖4 Western blot檢測T24細(xì)胞中蛋白表達(dá)情況Fig.4 Western blot analysis of protein expression in T24 cells

GroupsCleaved Caspase-3BaxPI3Kp-AKTBlank0.21±0.020.15±0.021.50±0.161.28±0.14NC0.20±0.020.14±0.021.47±0.151.25±0.13si-c-Met20.79±0.081)0.47±0.051)0.42±0.041)0.31±0.041)F142.62596.09168.50571.866P0.0000.0000.0000.000

Note:Compared with the blank group,1)P<0.05.

2.5沉默c-Met基因?qū)φ丈錀l件下T24細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測接受4 Gy放射后各組T24細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bax、PI3K和p-AKT，結(jié)果如圖4和表5所示，與Blank組比，si-c-Met2組T24細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，而Blank組和NC組各蛋白表達(dá)量比較差異不顯著(P>0.05)。提示放射條件下靶向沉默c-Met2基因可上調(diào)T24細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Bax的表達(dá)，下調(diào)PI3K和p-AKT的表達(dá)。

3 討論

膀胱癌的發(fā)病率在我國一直高居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤首位，嚴(yán)重影響著人們的身心健康[10]。膀胱癌患者術(shù)后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，導(dǎo)致患者預(yù)后不良，放射治療作為術(shù)后防治腫瘤復(fù)發(fā)常用的輔助治療手段而備受關(guān)注。但是，部分患者對放療不敏感大大限制了其效果，因此增強(qiáng)膀胱癌的放射敏感性對膀胱癌的臨床治療尤為重要。c-Met基因編碼的肝細(xì)胞生長因子受體是一種酪氨酸激酶，是酪氨酸激酶受體家族重要成員之一，能夠通過招募下游信號分子激活磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，引起一系列生物學(xué)效應(yīng)[11,12]。研究發(fā)現(xiàn)，c-Met在多種癌組織中呈過表達(dá)，如食管癌、骨肉瘤和前列腺癌等，且可以調(diào)節(jié)癌癥中的腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和存活[13-15]。前期研究檢測到c-Met在膀胱癌組織中亦呈高表達(dá)。因此本實(shí)驗(yàn)在膀胱癌T24細(xì)胞中轉(zhuǎn)染c-Met siRNA靶向沉默c-Met基因，經(jīng)qRT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染效果，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染c-Met siRNA能夠有效靶向沉默c-Met基因。報道顯示，c-Met還與各種腫瘤中的放射抗性有關(guān)[16,17]。關(guān)于腫瘤放射敏感性的具體機(jī)制目前尚不完全清楚，但研究顯示，抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與增強(qiáng)放射敏感性緊密相關(guān)[18,19]。例如，c-Met敲低可通過破壞端粒穩(wěn)態(tài)和抑制DNA損傷的修復(fù)來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的放射敏感性[20]。然而，c-Met基因是否參與膀胱癌細(xì)胞對放療敏感性的研究尚無相關(guān)報道。因此本實(shí)驗(yàn)通過沉默c-Met基因探討對膀胱癌放射敏感性的影響和潛在機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靶向沉默c-Met基因?qū)24細(xì)胞增殖能力無顯著影響，而經(jīng)放射線照射后，沉默c-Met基因的T24細(xì)胞克隆形成數(shù)目顯著降低，細(xì)胞存活數(shù)減少。細(xì)胞凋亡是由一系列凋亡相關(guān)基因誘導(dǎo)的細(xì)胞自主有序的細(xì)胞過程。其中Bax是Bcl-2基因家族促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，其過度激活可促進(jìn)細(xì)胞趨于死亡[21]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵蛋白酶，其激活形式Cleaved Caspase-3可促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[22]。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，經(jīng)4 Gy照射后沉默c-Met基因的細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組細(xì)胞。Western blot檢測結(jié)果顯示，經(jīng)放射后各組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，提示沉默c-Met基因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與上調(diào)Cleaved Caspase-3和Bax的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，沉默c-Met基因可通過促進(jìn)放射誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制，增加放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來增強(qiáng)膀胱癌T24細(xì)胞放射敏感性。為進(jìn)一步探討沉默c-Met基因調(diào)節(jié)膀胱癌的放射敏感性的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測了經(jīng)放射后各組細(xì)胞中PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，沉默c-Met基因的T24細(xì)胞中PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。PI3K是磷脂酰肌醇激酶，其激活可促進(jìn)AKT的激活和轉(zhuǎn)位，而PI3K和AKT異常表達(dá)可過度激活PI3K/AKT信號通路。研究表明，PI3K/AKT信號通路的過度激活降低腫瘤細(xì)胞放射敏感性[23,24]。通過阻斷PI3K/AKT信號通路的活化來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放射的敏感性。Chen等[25]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oretinib通過抑制c-Met的磷酸化并激活下游PI3K/AKT等信號傳導(dǎo)途徑來增強(qiáng)食管鱗狀細(xì)胞癌的放射敏感性。據(jù)此提示靶向沉默c-Met基因可能通過抑制PI3K/AKT信號通路的激活增強(qiáng)膀胱癌T24細(xì)胞對放射的敏感性。

綜上，本研究表明靶向沉默c-Met基因可增加膀胱癌T24細(xì)胞放射敏感性，其可能的作用機(jī)制與抑制PI3K/AKT信號通路的激活有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)為膀胱癌放射治療提供新的作用靶點(diǎn)。