劉 陽 魏 俊 肖 貝 曾 琴

(武漢市傳染病醫(yī)院肺結核科，武漢 430023)

乙肝病毒X蛋白結合蛋白(hepatitis B X-interacting protein，HBXIP)是哺乳動物中一種高度保守的細胞組成型表達蛋白，在惡性腫瘤組織中高表達，作為癌蛋白受到研究者的廣泛關注[1]。已有研究報道，HBXIP在非小細胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中高表達，通過影響腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等促進腫瘤進展，與腫瘤不良預后密切相關[2-4]。肝癌相關研究表明，HBXIP在肝癌組織和癌細胞中高表達與肝癌組織分化、TNM分期及癌栓形成及癌細胞免疫逃逸有關[5,6]。但目前HBXIP對肝癌細胞增殖和遷移的影響及其機制尚未完全闡明。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)及其下游蛋白激酶B(Akt)所組成的PI3K/Akt信號通路是調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、分化和葡萄糖轉運等功能的重要通路，一直是腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移等惡性生物學行為的研究熱點[7,8]。本研究分析HBXIP對肝癌細胞增殖和遷移的影響，旨在揭示HBXIP對肝癌細胞增殖和遷移的影響是否與PI3K/Akt信號通路有關。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人正常肝臟細胞HL7702和人肝癌細胞HepG2、Hep3B、Huh7由中國科學院上海細胞庫提供。

1.1.2主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；青霉素和鏈霉素(Solarbio公司)；pcDNA3.1-HBXIP質(zhì)粒、siRNA-HBXIP由廣州銳博生物科技有限公司構建；LY294002(PI3K抑制劑，Apexbio公司)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司)；SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒(ABI公司)；MTT試劑和二甲基亞砜(Solarbio公司)；鼠抗人HBXIP單克隆抗體、兔抗人PI3K單克隆抗體、兔抗人p-PI3K單克隆抗體、兔抗人p-Akt多克隆抗體、兔抗人Akt多克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體及辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠IgG二抗(Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將HL7702、HepG2、Hep3B、Huh7細胞接種于RPMI1640完全培養(yǎng)基(含青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml，10%胎牛血清)，置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)中培養(yǎng)。當細胞90%鋪滿培養(yǎng)瓶后，加入胰酶消化細胞進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2qRT-PCR實驗 收集對數(shù)生長期的HL7702、HepG2、Hep3B、Huh7細胞，采用TRIzol法抽提細胞總RNA，測定RNA樣品濃度和完整性，使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參基因，使用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒進行qPCR反應。HBXIP引物序列：正向5′-ATGGAGCCAGGTGCAGGTC-3′，反向5′-TGGAGGGATTCTTCATTGTG-3′；GAPDH引物序列：上游5′-ATCCCATCACCATCTTCC-3′，下游5′-TCCTTCCACGATACCAAA-3′。結果采用2-ΔΔCt法計算HBXIP mRNA相對表達水平。

1.2.3細胞轉染 選擇肝癌細胞HepG2進行后續(xù)實驗。收集對數(shù)生長期的肝癌細胞，制成單細胞懸液并以2×105個/孔接種于6孔板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞融合50%～70%時，將pcDNA3.1-HBXIP質(zhì)粒、siRNA-HBXIP轉染細胞，轉染36 h后檢測轉染效率，另將轉染pcDNA3.1空載體、siRNA陰性對照及未轉染的細胞作為對照，分別記為pcDNA-HBXIP組、si-HBXIP組、pcDNA組、si-NC組和空白組。每組設5個重復孔重復3次實驗。

1.2.4MTT實驗 收集對數(shù)生長期的空白組和穩(wěn)定轉染的pcDNA組、pcDNA-HBXIP組、si-NC組和si-HBXIP組肝癌細胞，制成單細胞懸液并以1×104個/孔接種于96孔板(加入或不加入LY294002處理)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0 h、24 h、48 h和72 h時，以20 μl/孔加入5 mg/ml的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除孔內(nèi)液體，以150 μl/孔加入二甲基亞砜溶液振蕩反應5 min。使用酶標儀測定每孔490 nm 波長處吸光度值。

1.2.5細胞劃痕實驗 收集對數(shù)生長期的空白組和穩(wěn)定轉染的pcDNA組、pcDNA-HBXIP組、si-NC組和si-HBXIP組肝癌細胞，制成密度為5×105個/ml的單細胞懸液，以500 μl/孔鋪于6孔板上，加入RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)至形成單層細胞。用10 μl無菌槍頭在單層細胞上劃痕，PBS溶液清洗3次，加入40 μg/ml的無氟尿嘧啶溶液孵育24 h，更換RMPI1640完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸去培養(yǎng)液，PBS溶液清洗3次，倒置顯微鏡下觀察并拍照。細胞遷移率(%)=(初次劃痕面積-末次觀察時劃痕面積)/初次劃痕面積×100%。

1.2.6Western blot實驗 收集對數(shù)生長期的HL7702、HepG2、Hep3B、Huh7細胞及轉染各組細胞，加入RIPA裂解液對細胞進行裂解，BCA法測定每個蛋白樣品的濃度。向蛋白樣品中加入5倍的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混勻，放入沸水浴中加入5 min使蛋白充分變性，蛋白樣品冷卻后進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后使用Bio-Rad濕式轉膜裝置將目的蛋白轉移至PVDF膜，洗膜1～2 min，加入5%脫脂奶粉中封閉1 h。加入1∶1 000稀釋的鼠抗人HBXIP單克隆抗體、兔抗人PI3K單克隆抗體、兔抗人p-PI3K單克隆抗體、兔抗人p-Akt多克隆抗體、兔抗人Akt多克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體4℃孵育過夜，洗膜1～2 min，加入1∶2 000 稀釋的辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠IgG二抗室溫孵育2 h。洗膜，加入ECL溶液顯色，曝光、拍照，應用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值并計算目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1HBXIP在人正常肝細胞株及肝癌細胞株中表達 與人正常肝細胞株HL7702比較，肝癌細胞株HepG2、Hep3B、Huh7中HBXIP mRNA相對表達水平均明顯升高(P<0.05，圖1A)，HBXIP蛋白相對表達水平均明顯升高(P<0.05，圖1B)。

2.2HBXIP過表達對肝癌細胞HepG2增殖的影響 與空白組和pcDNA組比較，pcDNA-HBXIP組肝癌細胞中HBXIP蛋白相對表達量明顯升高(P<0.05，圖2A)；MTT實驗結果，與空白組和pcDNA組比較，pcDNA-HBXIP組肝癌細胞在培養(yǎng)48 h和 72 h 時增殖活性明顯增強(P<0.05，圖2B)。說明過表達HBXIP促進肝癌細胞增殖。

圖1 HBXIP在人正常肝細胞株及肝癌細胞株中表達Fig.1 HBXIP expression in human normal liver cell lines and liver cancer cell linesNote: Compared with HL7702 cell,*.P<0.05.

圖2 HBXIP過表達對肝癌細胞HepG2增殖的影響Fig.2 Effect of HBXIP overexpression on proliferation of HepG2 cellsNote: Compared with blank group and pcDNA group,*.P<0.05.

2.3HBXIP過表達對肝癌細胞HepG2遷移的影響 劃痕實驗結果，空白組、pcDNA組和pcDNA-HBXIP組肝癌細胞遷移率分別為(33.82±2.79)%、(32.74±2.58)%、(58.17±4.11)%。與空白組和pcDNA組比較，pcDNA-HBXIP組肝癌細胞遷移率明顯升高(P<0.05)，說明過表達HBXIP促進肝癌細胞遷移(圖3)。

2.4沉默HBXIP對肝癌細胞HepG2增殖和遷移的影響 與空白組和si-NC組比較，si-HBXIP組肝癌細胞中HBXIP蛋白表達明顯降低(P<0.05，圖4A)，培養(yǎng)48 h和72 h時細胞增殖活性明顯降低(P<0.05，圖4B)；空白組、si-NC組和si-HBXIP組肝癌細胞遷移率分別為(33.75±2.81)%、(33.16±2.43)%、(18.17±1.35)%，si-HBXIP組肝癌細胞遷移率較空白組、si-NC組明顯降低(P<0.05，圖4C)。說明沉默HBXIP能夠抑制肝癌細胞增殖和遷移。

2.5HBXIP過表達對肝癌細胞HepG2中PI3K/Akt信號通路的影響 與空白組和pcDNA組比較，pcD-NAHBXIP組肝癌細胞中p-PI3K和p-Akt蛋白相對表達水平明顯升高(P<0.05)，PI3K和Akt蛋白相對表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖5)。

圖3 劃痕實驗檢測肝癌細胞遷移能力Fig.3 Scratch test to detect liver cancer cell migrationability

圖4 沉默HBXIP對肝癌細胞HepG2增殖和遷移的影響Fig.4 Effect of silencing HBXIP on proliferation and migration of HepG2 cellsNote: Compared with blank group and siNC group,*.P<0.05.

圖5 HBXIP過表達對肝癌細胞HepG2中PI3K/Akt通路的影響Fig.5 Effect of HBXIP overexpression on PI3K/Akt pathway of HepG2 cellsNote: Compared with blank group and pcDNA group,*.P<0.05.

圖6 LY294002對過表達HBXIP的肝癌細胞增殖和遷移的影響Fig.6 Effect of LY294002 on proliferation and migration of hepatoma cells overexpressing HBXIPNote: Compared with blank group and pcDNA group,*.P<0.05;compared with pcDNA-HBXIP group,#.P<0.05.

2.6LY294002對過表達HBXIP的肝癌細胞增殖和遷移的影響 與pcDNA-HBXIP組比較，pcDNA-HBXIP+LY294002組肝癌細胞增殖活性明顯受到抑制(P<0.05，圖6A)，細胞遷移率明顯降低(P<0.05，圖6B)。說明阻斷PI3K/Akt信號通路能夠逆轉過表達HBXIP對肝癌細胞增殖和遷移能力的促進作用。

3 討論

肝癌是威脅全球人類健康的主要惡性腫瘤之一，2014年中國分地區(qū)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析報告顯示[9]，肝癌在我國中、東、西部地區(qū)死亡率均居第2位。肝癌預后危險因素分析表明，腫瘤大小、血管侵犯、淋巴結轉移是影響肝癌預后的獨立危險因素[10,11]。控制癌細胞增殖和遷移對肝癌臨床治療及預后改善具有重要意義。

人的HBXIP基因定位于染色體1p13.3，編碼分子量約19 kD的蛋白。最初認為HBXIP與乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的C末端結合，作為癌蛋白在控制細胞增殖、凋亡和分裂中發(fā)揮作用。近年來越來越多的研究關注HBXIP在癌癥發(fā)生及進展中的分子機制，HBXIP在乳腺癌中高表達，通過激活轉錄因子Sp1上調(diào)成纖維細胞生長因子4(FGF4)促進乳腺癌細胞遷移，通過轉錄因子E2F1誘導PKM2上調(diào)表達促進乳腺癌細胞增殖[12,13]。HBXIP通過激活轉錄因子c-Myb上調(diào)Hippo通路下游效應蛋白YAP，促進肝癌生長[14]。提示HBXIP作為一種癌蛋白可通過調(diào)節(jié)癌相關轉錄因子表達激活癌癥細胞生長相關通路，進而促進癌癥進展。

本研究結果表明，HBXIP在肝癌細胞株HepG2、Hep3B、Huh7中均高表達，以肝癌HepG2細胞為研究對象，構建過表達HBXIP和抑制表達HBXIP的肝癌細胞，發(fā)現(xiàn)過表達HBXIP明顯促進肝癌細胞增殖和遷移，而抑制HBXIP表達后肝癌細胞增殖和遷移能力明顯降低。說明HBXIP在肝癌細胞中高表達對細胞增殖和遷移具有促進作用，抑制HBXIP可能是肝癌的潛在治療靶點。

PI3K/Akt信號通路是真核細胞中重要的信號轉導通路之一，通過影響下游多種效應因子的活化狀態(tài)在促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、促進腫瘤耐藥等多種生物過程中起關鍵作用[15-17]。HBXIP基因過表達促進腺樣囊性癌細胞株ACC-M增殖、遷移和侵襲，其作用機制可能與促進PI3K、Akt磷酸化有關[18]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，HBXIP在肝癌細胞中過表達后細胞中PI3K和Akt總體水平無明顯變化，但p-PI3K、p-Akt蛋白表達明顯升高，說明HBXIP在肝癌細胞中高表達能夠促進PI3K、Akt磷酸化，即激活PI3K/Akt信號通路。有研究表明，PI3K/Akt信號通路在維持HepG2細胞中腫瘤干細胞比例及特性中起重要作用，是肝癌對索拉菲尼耐藥的重要因素，也是調(diào)節(jié)肝癌細胞生長、增殖、遷移和侵襲的重要機制[19-21]。為證實HBXIP促進肝癌細胞增殖和遷移的作用是否與激活PI3K/Akt信號通路有關，本研究用LY294002阻斷PI3K/Akt信號通路，發(fā)現(xiàn)過表達HBXIP的肝癌細胞增殖和遷移能力明顯降低，說明與腺樣囊性癌細胞中一樣，HBXIP對肝癌細胞增殖和遷移的促進作用與PI3K/Akt信號通路有關。

綜上所述，本研究初步證明HBXIP在肝癌細胞中高表達，可能通過激活PI3K/Akt信號通路促進肝癌細胞增殖和遷移，提示靶向干擾HBXIP的表達可能對改善肝癌預后具有積極意義。但該作用途徑中的具體分子機制仍需進一步深入探討。