李京蔓 潘宇晨 夏曉雨 李 丹 竇 環(huán) 侯亞義

(南京大學醫(yī)學院,南京 210093)

自古以來，我們中國人就重視養(yǎng)生保健。宋元時期，以動物乳汁、血液為代表的液體補品開始流行，貴族間盛行喝鹿血，“養(yǎng)巨鹿日刺其血和酒以飲”。清朝皇帝喝鹿血，將其作為壯陽、養(yǎng)生補品來服用。鹿血晶系鹿血經(jīng)炮制加工干燥后制得的產(chǎn)品。鹿血泛指鹿科動物梅花鹿和馬鹿的血液，其主要化學成分包括蛋白質(zhì)、氨基酸、酶類、維生素、脂肪酸及激素類等物質(zhì)[1，2]。近年來的研究表明，鹿制品如鹿血、鹿角盤等具有延緩衰老、抗疲勞、增強免疫力、抗氧化、消炎鎮(zhèn)靜等功能[3，4]。

固有免疫系統(tǒng)是機體低于外界病原體的有力屏障[5]，巨噬細胞作為一種重要的固有免疫細胞，能夠通過釋放炎癥因子，殺傷外來病原體并將其吞噬，保護機體免遭侵害[6]。對巨噬細胞的免疫功能進行適當調(diào)節(jié)能夠幫助機體抵抗疾病[7]。本文旨在研究鹿血晶對小鼠巨噬細胞系RAW 264.7的免疫調(diào)節(jié)作用及其可能機制，為鹿血晶作為保健中藥材的應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 RAW 264.7細胞系購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；鹿血晶凍干粉來自蘇州紅冠莊國藥股份有限公司(批號：S1810012)；DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素及 FBS 均購自美國 Gibco；CCK-8 試劑購自日本 DOJINDO；一氧化氮檢測試劑盒購自上海碧云天；IL-1β ELISA檢測試劑盒購自北京達科為生物技術(shù)有限公司；IL-6 ELISA檢測試劑盒購自南京福麥斯生物技術(shù)有限公司；磷酸化IKK-α/β及磷酸化P65抗體均購自美國 CST；GAPDH抗體購自美國 Proteintech；FITC熒光素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 在生物安全柜中，將RAW 264.7細胞接種于直徑60 mm細胞培養(yǎng)皿中，加入3 ml含10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁生長。每1～2 d換一次液，細胞數(shù)大于1×107ml-1時按1∶5或1∶6傳代一次，使細胞保持圓整、透亮的形態(tài)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2鹿血晶水溶液的制備 向20 ml去離子水中加入1 g鹿血晶凍干粉末，充分混勻后于37℃水浴加熱至無明顯顆粒狀物質(zhì)存在。再次混勻后用200目尼龍濾布過濾掉不溶物，濾液在超凈臺內(nèi)用0.22 μm孔徑的濾器過濾，得到無菌鹿血晶水溶液。

1.2.3CCK-8實驗 使用終濃度為0、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000 μg/ml的鹿血晶水溶液處理RAW 264.7細胞，1 h后加入LPS(100 ng/ml)刺激，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，棄去上清，每孔加入10 μl CCK-8試劑和90 μl DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至顏色變?yōu)槌赛S色。放入酶標儀，于450 nm波長下測定吸光度A450，細胞活力計算方式為：細胞活力(%)=[A450(加藥)-A450(空白)]/[A450(空白對照)-A450(空白)]×100%。

1.2.4qRT-PCR實驗 將RAW 264.7細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，貼壁生長至匯合度為50%～60%，加入鹿血晶水溶液使其終濃度為250、500、1 000 μg/ml，培養(yǎng)1 h后，加入LPS使終濃度為100 ng/ml，培養(yǎng)24 h后，Trizol法提取總RNA。RNA用適量DEPC水溶解，Nanodrop測定RNA濃度和純度，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑說明書將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，程序為50℃ 15 min、85℃ 5 s、4℃ ∞。

qRT-PCR實驗操作如下：(1)10 μl qRT-PCR反應(yīng)體系：5 μl cDNA、4 μl PowerUp SYBR Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific)、1 μl 引物(正義鏈0.5 μl、反義鏈0.5 μl)。(2)qRT-PCR反應(yīng)程序(采用三步法)：①預變性：55℃ 2 min、95℃ 10 min；②循環(huán)40次，72℃時收集信號：95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s；③熔解曲線：95℃ 15 s、60℃ 30 s、95℃ 15 s；采用Applied BioSystems 7300 Sequence Detection System 進行檢測并分析，以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)各個基因的Ct值結(jié)果，以2-ΔΔCt法計算，得到目的基因的相對表達量。

1.2.5一氧化氮檢測和ELISA實驗 將RAW 264.7細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，貼壁生長至匯合度為50%～60%，加入鹿血晶水溶液使其終濃度為250、500、1 000 μg/ml，培養(yǎng)1 h后，加入LPS使終濃度為100 ng/ml。培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)基，7 500 g離心5 min，小心吸取上清到新EP管中，依照試劑盒說明書對培養(yǎng)基上清中的一氧化氮、IL-1β和IL-6含量進行檢測。

1.2.6Western blot實驗 將RAW 264.7細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，貼壁生長至匯合度為80%～90%，加入鹿血晶水溶液使其終濃度為250、500、1 000 μg/ml，培養(yǎng)1 h后，加入LPS使終濃度為100 ng/ml，培養(yǎng)30 min后，提取總蛋白。上樣20 μl于10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，以 80 V恒壓電泳,待溴酚藍指示劑跑出濃縮膠后加壓至120 V，直到溴酚藍泳出分離膠下緣。350 mA恒流冰浴轉(zhuǎn)移2 h。將轉(zhuǎn)膜后的 PVDF 膜放入5%BSA 封閉液中低速搖床封閉2 h。用洗膜緩沖液(tris buffered saline tween,TBST)高速搖床洗膜15 min，連續(xù)4次。制作孵育袋，加入5%BSA稀釋的一抗液，4℃低速搖床孵一抗過夜。用TBST 洗膜4次后，浸泡于5%BSA稀釋的二抗液，低速搖床孵二抗2 h。用TBST洗膜4次后，曝光儀曝光、拍照、軟件分析圖像。

1.2.7大腸桿菌吞噬實驗 將RAW 264.7細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，貼壁生長至匯合度為70%～80%，加入鹿血晶水溶液使其終濃度為500 μg/ml，培養(yǎng)1 h后，每孔加入5×107個FITC標記的大腸桿菌，共同培育6 h。收集細胞進行流式細胞術(shù)檢測，用FITC的平均熒光強度(MFI)表示吞菌能力的大小，或固定、制片，于熒光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1鹿血晶提高炎癥狀態(tài)下RAW 264.7細胞的細胞活力 使用不同濃度的鹿血晶處理RAW 264.7細胞，而后加入LPS(100 ng/ml)進行刺激，24 h后通過CCK-8法進行檢測，結(jié)果如圖1所示。與LPS組相比，鹿血晶不會損傷炎癥狀態(tài)下巨噬細胞的細胞活力，且125～4 000 μg/ml濃度范圍內(nèi)的鹿血晶對其活力均有明顯提高。結(jié)果表明，一定濃度的鹿血晶能夠提高LPS刺激下的RAW 264.7細胞活力。

2.2鹿血晶抑制炎癥狀態(tài)下RAW 264.7細胞炎癥因子mRNA的表達 通過qRT-PCR實驗檢測鹿血晶對LPS刺激下RAW 264.7細胞炎癥因子iNOS、IL-1β、IL-6的mRNA表達水平的影響，結(jié)果如圖2所示。與LPS組相比，低(250 μg/ml)、中(500 μg/ml)、高(1 000 μg/ml)三個濃度的鹿血晶水溶液均能夠明顯抑制LPS誘導的RAW 264.7細胞中iNOS、IL-1β、IL-6表達水平的上調(diào)，且呈劑量依賴性。結(jié)果表明，鹿血晶能夠抑制LPS刺激下巨噬細胞炎癥因子的表達。

圖1 鹿血晶對RAW 264.7細胞活力的影響Fig.1 Effects of deer blood crystal on viability of RAW 264.7 cellsNote: **.P<0.01，***.P<0.001.

圖2 鹿血晶對RAW 264.7細胞內(nèi)炎癥因子表達的影響Fig.2 Effects of deer blood crystal on inflammatory cytokines expression of RAW 264.7 cellsNote: *.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.3鹿血晶抑制炎癥狀態(tài)下RAW 264.7細胞炎癥因子的釋放 收集鹿血晶和LPS共同處理后RAW 264.7細胞的培養(yǎng)基上清，通過ELISA實驗檢測鹿血晶對RAW 264.7細胞炎癥因子一氧化氮(NO)、IL-1β、IL-6釋放量的影響，結(jié)果如圖3所示。與LPS相比，低(250 μg/ml)、中(500 μg/ml)、高(1 000 μg/ml)三個濃度的鹿血晶水溶液均能夠明顯抑制RAW 264.7細胞在LPS誘導下NO和IL-6的釋放，且呈劑量依賴性，但對IL-1β無明顯作用。結(jié)果表明，鹿血晶能夠抑制LPS刺激下巨噬細胞炎癥因子的釋放。

2.4鹿血晶抑制炎癥狀態(tài)下RAW 264.7細胞NF-κB信號通路的活化 通過Western blot實驗檢測鹿血晶對炎癥狀態(tài)下RAW 264.7細胞內(nèi)NF-κB信號通路蛋白表達的影響，結(jié)果如圖4所示。與LPS組相比，鹿血晶能夠明顯降低炎癥狀態(tài)下RAW 264.7細胞內(nèi)磷酸化IKK-α/β和磷酸化P65蛋白的表達，說明鹿血晶能夠抑制LPS引起的NF-κB信號通路的活化。結(jié)果表明，鹿血晶通過NF-κB信號通路影響巨噬細胞炎癥因子的表達與釋放。

圖3 鹿血晶對RAW 264.7細胞內(nèi)炎癥因子釋放的影響Fig.3 Effects of deer blood crystal on inflammatory cytokines release of RAW 264.7 cellsNote: **.P<0.01,***.P<0.001.

圖4 鹿血晶對RAW 264.7細胞內(nèi)NF-κB相關(guān)蛋白表達的影響Fig.4 Effects of deer blood crystal on NF-κB-related proteins expression in RAW 264.7 cellsNote: *.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖5 鹿血晶對RAW 264.7細胞吞噬大腸桿菌能力的影響Fig.5 Effect of deer blood crystal on ability of RAW 264.7 cells to phagocytose E.coliNote: **.P<0.01.

2.5鹿血晶能夠促進RAW 264.7細胞對細菌的吞噬作用 利用500 μg/ml鹿血晶預處理RAW 264.7細胞后，加入標記FITC熒光素的大腸桿菌刺激，6 h后通過流式細胞術(shù)檢測RAW 264.7細胞吞噬大腸桿菌的能力，結(jié)果如圖5A所示。與未加入鹿血晶而僅僅加入大腸桿菌刺激的E.coli組相比，鹿血晶能夠明顯提高RAW 264.7細胞內(nèi)FITC的平均熒光強度。免疫熒光試驗得到了同樣的結(jié)果，如圖5B所示。結(jié)果表明，鹿血晶能夠提高巨噬細胞吞噬大腸桿菌的能力。

3 討論

鹿血晶系鹿血經(jīng)炮制加工干燥后制得的產(chǎn)品。鹿血具有抗衰老、補氣補血、調(diào)節(jié)免疫、促進傷口愈合等功效[3，4]。本次研究，我們證明了一定濃度范圍內(nèi)的鹿血晶不會降低炎癥狀態(tài)下巨噬細胞系RAW 264.7的細胞活力，甚至能夠提高其細胞活力。這說明鹿血晶作為一種保健品，適量服用不會對身體產(chǎn)生毒性，具體服用劑量還需要通過動物實驗以及藥代動力學研究獲得。

巨噬細胞作為一種重要的固有免疫細胞，能夠通過釋放炎癥因子，殺傷外來病原體并將其吞噬，保護機體免遭侵害[6]。免疫力低下的人如嬰幼兒、老年人等更容易受到病原體的感染[8，9]。通過檢測RAW 264.7細胞對大腸桿菌的吞噬能力發(fā)現(xiàn)，鹿血晶能夠促進巨噬細胞吞噬大腸桿菌，這意味著鹿血晶能夠提高巨噬細胞的免疫防御能力。

炎癥是一把雙刃劍，可控的炎癥有利于抵御外來病原體的入侵，但持續(xù)的炎癥往往會造成組織損傷、傷口無法愈合、發(fā)熱，甚至演化成癌癥[10，11]。因此，炎癥發(fā)生與炎癥消散之間需要建立微妙的平衡，必要時需要藥物輔助。巨噬細胞是炎癥的重要參與者，其過度激活會造成持續(xù)的炎癥。本次研究中發(fā)現(xiàn)，鹿血晶能夠顯著抑制LPS誘導的炎癥狀態(tài)下RAW 264.7細胞炎癥因子iNOS、IL-1β、IL-6的表達與釋放，說明鹿血晶具有抑炎作用。

NF-κB信號通路是介導免疫細胞參與炎癥反應(yīng)的重要通路，它的活化能夠引起免疫細胞產(chǎn)生和釋放炎癥因子[12，13]。Western blot實驗結(jié)果表明，鹿血晶能夠抑制炎癥狀態(tài)下RAW 264.7細胞內(nèi)的NF-κB信號的活化，說明鹿血晶能夠通過抑制巨噬細胞NF-κB信號通路的活化從而發(fā)揮抑炎作用。

綜上，鹿血晶能夠增強巨噬細胞吞噬大腸桿菌的能力，并且在不影響細胞活力的同時作用于NF-κB信號通路，抑制炎癥狀態(tài)下巨噬細胞炎癥因子的表達與釋放。