王丹維，張方方，金 亮，吳 潔

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京210009）

2型糖尿病是由遺傳和環(huán)境等因素導(dǎo)致的以高血糖為主要特征的慢性非傳染性疾?。?］。糖尿病可引發(fā)多種并發(fā)癥，包括心腦血管疾病、腎衰竭、失明等，嚴(yán)重的胰島素抵抗也是非酒精性脂肪肝病最主要的致病因素［2］，極大影響患者的生活質(zhì)量，并給患者家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，成為全球公認(rèn)的醫(yī)療衛(wèi)生保健問題。因此闡明糖尿病的發(fā)病機(jī)制，探究引起糖尿病發(fā)生的新靶點(diǎn)，對糖尿病的診斷和防治意義重大。MicroRNA（miRNA）是一種內(nèi)源的短片段非編碼RNA，約含20～22個堿基，通過與mRNA的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，引起靶基因剪切或抑制靶基因的翻譯從而對其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控［3］。目前研究發(fā)現(xiàn)許多miRNA參與調(diào)控糖尿病的發(fā)生、發(fā)展［4-5］。比如，miR-335已被證明以編碼胰島素分泌相關(guān)的SNARE復(fù)合物成員的mRNA為靶點(diǎn)［6］；miR-375也被報道可通過反饋環(huán)節(jié)被高水平的葡萄糖負(fù)調(diào)控，因?yàn)槠淇赏ㄟ^靶向PDK1減弱胰島素基因轉(zhuǎn)錄［7］；另有研究表明Min6細(xì)胞暴露于高葡萄糖環(huán)境可導(dǎo)致多個miRNA表達(dá)水平的改變，其中miR-30d被發(fā)現(xiàn)參與胰島素基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)［8］；同樣，小鼠胰島中 miR-15a表達(dá)的變化與胰島素基因 mRNA水平相關(guān)［9］。以上研究均表明，miRNA對胰島β細(xì)胞具有重要的調(diào)控作用。但目前關(guān)于miRNA調(diào)控胰島β細(xì)胞功能的具體機(jī)制尚未完全闡明。因此揭示并完善miRNA調(diào)控胰島β功能的機(jī)制，是糖尿病研究領(lǐng)域中亟待解決的重要科學(xué)問題。

本課題組前期通過高通量測序發(fā)現(xiàn)與正常飲食小鼠胰島組織相比，在高脂飲食模型小鼠胰島組織中miR-802的表達(dá)水平顯著升高。且新近研究表明，miR-802直接與 NF-κB抑制因子（NRF）的3′-UTR結(jié)合并抑制其表達(dá)，介導(dǎo)肥胖相關(guān)腎?。?0］；同時在小鼠肝臟中miR-802的過表達(dá)損害葡萄糖耐受性，并降低胰島素敏感性，而miR-802表達(dá)的降低則改善了葡萄糖耐量和胰島素作用［11］。因此，miR-802對糖尿病的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

但是miR-802是否能直接調(diào)控胰島β細(xì)胞的功能，目前尚未有文獻(xiàn)報道。為了深入探討miR-802對胰島β細(xì)胞功能的調(diào)控作用，本研究利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在胰島原代細(xì)胞和Min6細(xì)胞中過表達(dá)或敲降miR-802，通過ELISA及Western blot等實(shí)驗(yàn)揭示miR-802胰島β細(xì)胞的功能及其作用機(jī)制。

1 材 料

1.1 試 劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640完全培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；LipofectamineTM2000、Trizol試劑（南京諾唯贊公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、胰蛋白酶（上海碧云天生物公司）；割膠回收試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；兔抗鼠 Hnf1B單克隆抗體、兔抗鼠GAPDH單克隆抗體（美國Abcam公司）；miR-802類似物及其陰性對照，miR-802抑制劑及其陰性對照、miR-RNA實(shí)時熒光定量RT-PCR定量試劑盒（上海吉瑪制藥技術(shù)公司）；All-in-one逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量RT-qPCR試劑盒（美國abm公司）；V型膠原酶（美國 Sigma-Aldrich公司）；T4 DNA連接酶（日本TaKaRa公司）。

1.2 儀 器

480II實(shí)時熒光定量儀（美國 Roche公司）；Synergy熒光酶標(biāo)儀（美國Biotek公司）；TS2R顯微圖像采集系統(tǒng)（日本 Olympus公司）；Trans-Blot Turbo Western blot電泳轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；4600蛋白曝光儀（上海Tanon公司）。

1.3 質(zhì)粒、細(xì)胞和動物

大腸埃希菌、293T細(xì)胞、pMIR-REPORT質(zhì)粒、海腎質(zhì)粒、pcDNA3.1（＋）質(zhì)粒、PLVX-shRNA2質(zhì)粒均保存于本實(shí)驗(yàn)室。胰島β細(xì)胞系Min6細(xì)胞由南京醫(yī)科大學(xué)韓曉教授課題組提供。6～8周齡C57BL／6J小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號SCXK（蘇）2017-0007。所有動物實(shí)驗(yàn)均符合動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和提取

Min6細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)和胰島原代細(xì)胞的提取均按文獻(xiàn)［12］的方法進(jìn)行。

2.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

將miR-802類似物及其陰性對照、miR-802抑制劑及其陰性對照的干粉于常溫離心機(jī)中12 000 r／min離心5 min，之后加入ddH2O溶解粉末，配制為20μmol／L的儲存液，將儲存液分裝后于-20℃保存。取培養(yǎng)于6孔板中的細(xì)胞，按照LipofectamineTM2000說明書的要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染，先將細(xì)胞上清換成無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)4 h，之后將待轉(zhuǎn)染的miRNA和LipofectamineTM2000按照體積比1∶2加入到無血清培養(yǎng)基中，并使miRNA在培養(yǎng)基中的終濃度為100μmol／L，6 h后換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

自45年前康寧發(fā)明第一根低損耗光纖至今，康寧始終引領(lǐng)通信行業(yè)的變革。作為光通信行業(yè)唯一的端到端解決方案供應(yīng)商，康寧光通信業(yè)務(wù)在中國為客戶提供從光纖、光纜到連接設(shè)備的全方位差異化解決方案，致力于應(yīng)對搭建新一代網(wǎng)絡(luò)和5G網(wǎng)所面臨的挑戰(zhàn)。

2.3 葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS）實(shí)驗(yàn)

將純凈的胰島原代細(xì)胞均勻鋪在12孔板中，并設(shè)置每孔中胰島細(xì)胞的數(shù)量為30個。加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基100μL（含10%胎牛血清），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱平衡12 h，并將Min6細(xì)胞（1×107個）接種于12孔板，按照“2.2”項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)染步驟，在胰島細(xì)胞和Min6細(xì)胞中過表達(dá)或敲降miR-802，轉(zhuǎn)染 48 h后，用含 2.5 mmol／L葡萄糖的Hank′s平衡鹽溶液緩沖液作為饑餓液培養(yǎng)6 h，之后分別用2.5和25 mmol／L的葡萄糖刺激2 h，刺激結(jié)束之后，收集細(xì)胞上清液，用小鼠胰島素ELISA試劑盒檢測上清液中胰島素的含量，同時用細(xì)胞刮刀將接種的細(xì)胞完全刮下，收集細(xì)胞后用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，用每孔胰島素的含量（μIU）／每孔細(xì)胞蛋白含量（mg）作為胰島素分泌能力的評價指標(biāo)。

2.4 靶基因預(yù)測和雙熒光素酶檢測實(shí)驗(yàn)

根據(jù) TargetScan（http:／／www.targetscan.org／vert＿72／），miRBase（http:／／www.mirbase.org／），miRwalk（http:／／mirwalk.umm.uni-heidelberg.de／）網(wǎng)站預(yù)測miR-802潛在的靶基因，利用Bibiserv2（https:／／bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de／rnahybrid／）計算靶基因與miRNA的結(jié)合自由能，將預(yù)測到的靶基因合成包含酶切位點(diǎn)和目的片段的3′-UTR種子序列，人工合成野生型片斷上下游引物（Hnf1B-WTF／R），在野生型片斷的基礎(chǔ)上合成種子序列互補(bǔ)序列的突變位點(diǎn)，合成突變片段（Hnf1B-MU-F／R），片段長度為59 bp，序列如表1所示。

Table 1 Sequence used for luciferase report assay

將合成的單鏈退火，使用T4 DNA連接酶將退火產(chǎn)物與酶切后的pMIR-REPORT質(zhì)粒進(jìn)行連接重組，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸埃希菌中，提取質(zhì)粒。MiR-802與pMIR-REPORT重組質(zhì)粒、海腎質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞:提前將293T細(xì)胞均勻鋪至24孔板中，轉(zhuǎn)染3種質(zhì)粒，每種設(shè)置3個平行孔。293T細(xì)胞鋪板密度為每孔2×105個，體系500μL，轉(zhuǎn)染前將24孔板中換成400μL不含抗生素和血清的培養(yǎng)基，4～6 h后開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染結(jié)束后48 h使用雙熒光素酶報告試劑盒對其熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測。

2.5 Western blot法檢測Hnf1B蛋白的表達(dá)

向上述步驟中獲得的胰島原代細(xì)胞和Min6細(xì)胞中分別加入RIPA裂解液（含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑），置于冰上用細(xì)胞刮刀刮下，每隔10分鐘渦旋10 s，使細(xì)胞得到充分的裂解，加入5×上樣緩沖液溶液，并用PBS將蛋白濃度調(diào)整為1.0μg／μL，將制備好的樣品置于100℃金屬浴中煮10 min。利用5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行電泳，先將電壓設(shè)置成80 V，待樣品跑到濃縮膠和分離膠的分界線時，調(diào)整電壓為140 V，整個電泳持續(xù)約90 min。將PVDF膜用甲醇活化10 min后，使用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移后將膜置3%脫脂牛奶中室溫封閉1 h。封閉結(jié)束，用TBST洗膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)的按1∶1 000稀釋的一抗（兔抗鼠Hnf1B單克隆抗體、兔抗鼠GAPDH單克隆抗體），將樣品在4℃冰箱中過夜孵育。一抗孵育之后，洗膜3次，每次10 min，后加入相對應(yīng)的二抗孵育1 h，二抗孵育結(jié)束之后，繼續(xù)洗膜3次并于曝光儀中曝光。

2.6 RNA的提取和qPCR

在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中加入Trizol裂解液1 mL，將細(xì)胞充分裂解后提取細(xì)胞RNA，使用qPCR試劑盒，分別將RNA反轉(zhuǎn)錄成普通cDNA和miR-802的cDNA，進(jìn)行qPCR。qPCR過程中所使用的引物序列如表2所示。其中CYC為Hnf1B的內(nèi)參；U6為miR-802的內(nèi)參。

Table 2 Primers used for qPCR

2.7 質(zhì)粒構(gòu)建

在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找Hnf1B的編碼序列，以Min6細(xì)胞的cDNA作為模板擴(kuò)增Hnf1B的編碼區(qū)，Hnf1B全長1 599 bp，利用割膠回收試劑盒回收所得到的片段，選用pcDNA3.1（＋）真核生物表達(dá)質(zhì)粒，將回收得到的片段和pcDNA3.1（＋）質(zhì)粒用Bam HⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切（37℃酶切6 h），將酶切后的質(zhì)粒割膠回收，利用T4DNA連接酶將質(zhì)粒和片段于37℃過夜連接12 h，連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌，挑取單克隆菌測序，成功構(gòu)建的過表達(dá)質(zhì)粒命名為 over-Hnf1B；同時空載的pcDNA3.1（＋）作為over-Hnf1B的對照質(zhì)粒。利用 shRNA 數(shù) 據(jù) 庫 （http:／／sirna.wi.mit.edu／home.php）設(shè)計 Hnf1B的序列，采用 Bam HⅠ和Eco RⅠ作為酶切位點(diǎn)，用上述同樣的方法，將其構(gòu)建在PLVX-shRNA2的載體上，構(gòu)建成功的敲除質(zhì)粒命名為sh-Hnf1B（PCR引物見表3）。利用空載的PLVX-shRNA2載體作為shHnf1B的對照質(zhì)粒。

Table3 Primers used for PCR

2.8 功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)

分別將30個純凈的胰島原代細(xì)胞和1×107個Min6細(xì)胞接種于12孔板，將待實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞分為4組，根據(jù)LipofectamineTM2000說明書的方法，分別轉(zhuǎn)染miR-802類似物及其陰性對照、over-Hnf1B和miR-802類似物＋over-Hnf1B，轉(zhuǎn)染48 h后，按“2.3”項(xiàng)方法進(jìn)行GSIS實(shí)驗(yàn)，檢測胰島素的分泌能力。

2.9 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié) 果

3.1 miR-802在Min6和胰島原代細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證

將miR-802類似物及其陰性對照，miR-802抑制劑及其陰性對照分別轉(zhuǎn)染至Min6和胰島原代細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后通過qPCR檢測轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-802類似物的組中miR-802表達(dá)顯著上調(diào)，在Min6細(xì)胞和胰島原代細(xì)胞中分別上調(diào)至對照組的300倍和200倍。轉(zhuǎn)染miR-802抑制劑組與對照組相比，則顯著抑制了miR-802的表達(dá)，在Min6細(xì)胞和胰島原代細(xì)胞中分別下調(diào)至對照組80%及60%，上述結(jié)果說明miR-802類似物和miR-802抑制劑可以作為上調(diào)和抑制miR-802表達(dá)的有效工具。

3.2 miR-802調(diào)控胰島素的分泌

經(jīng)葡萄糖刺激后Min6細(xì)胞和胰島原代細(xì)胞的胰島素分泌結(jié)果如圖2所示，用高糖或低糖刺激時，過表達(dá)miR-802可明顯抑制Min6細(xì)胞和胰島原代細(xì)胞分泌胰島素，而敲降 miR-802則促進(jìn)Min6細(xì)胞和胰島原代細(xì)胞分泌胰島素。以上結(jié)果均表明miR-802能夠調(diào)控胰島β細(xì)胞胰島素的分泌。

Figure 1 qPCR verified the transfection efficiency of miR-802 in Min6 cells（A）and islet primary cell（B）（xˉ±s，n＝3）A:Relative miR-802 level in Min6；B:Relative miR-802 level in islet***P＜0.001

Figure 2 Effect of miR-802 on insulin secretion of Min6（A）and primary islet cells（B）（xˉ±s，n＝3）*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

3.3 miR-802靶基因的初步驗(yàn)證

利用miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-802的潛在靶基因，結(jié)合miR-802對胰島β細(xì)胞的生物學(xué)功能，篩選出Hnf1B為miR-802的潛在靶基因，通過軟件Bibiserv2預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)miR-802與Hnf1B靶向性結(jié)合的自由能為-91.7 kJ／mol，說明Hnf1B與miR-802的結(jié)合位點(diǎn)具有高度保守性（圖3-A），同時雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，Hnf1B螢火蟲熒光素酶的相對熒光強(qiáng)度能夠被miR-802類似物抑制，但能被miR-802抑制劑增強(qiáng)（圖3-C）。上述結(jié)果表明Hnf1B可能是miR-802的靶基因。

Figure 3 Prediction and preliminary verification of miR-802 target geneA:Target binding free energy of miR-802 and Hnf1B was predicted and analyzed by bibiserv2；B:Target binding sequence of miR-802 and Hnf1B was predicted by targetscan；C:Target relationship between miR-802 and Hnf1B was preliminarily verified by double luciferase reporter gene（±s，n＝3）***P＜0.001

3.4 Western blot和qPCR驗(yàn)證miR-802靶向Hnf1B

為了進(jìn)一步確證miR-802靶向Hnf1B，本研究利用Western blot和qPCR進(jìn)一步確認(rèn)。結(jié)果如圖4所示，在Min6細(xì)胞中過表達(dá)miR-802可以顯著降低靶基因Hnf1B的蛋白和mRNA水平，而在Min6細(xì)胞中敲除miR-802時觀察到相反的現(xiàn)象。

3.5 Hnf1B促進(jìn)胰島素分泌

Hnf1B是對胰腺細(xì)胞形成和維持血糖穩(wěn)態(tài)具有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。為了研究Hnf1B是否能調(diào)控胰島β細(xì)胞功能，本研究通在Min6和胰島原代細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-Hnf1B和Hnf1B過表達(dá)載體，通過qPCR及Western blot驗(yàn)證Hnf1B的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示Hnf1B在Min6細(xì)胞中過表達(dá)約300倍，降低至70%（圖5-A）；在胰島原代細(xì)胞中Hnf1B被過表達(dá)約250倍降低至70%（圖5-B）。接著在Min6細(xì)胞及胰島原代細(xì)胞中開展GSIS實(shí)驗(yàn)，ELISA檢測結(jié)果顯示Hnf1B可以顯著促進(jìn)Min6細(xì)胞（圖5-C）和胰島原代細(xì)胞（圖5-D）分泌胰島素。以上結(jié)果表明Hnf1B可調(diào)控胰島β細(xì)胞分泌胰島素。

Figure 4 Effects of miR-802 on the protein and mRNA expression of Hnf1B in Min6 cells（xˉ±s，n＝3）.***P＜0.001

Figure5 Effect of Hnf1B on the secretory function of isletβcells.Overexpression and knockdown of Hnf1B in Min6 and primary islet cells respectively A:Changes in protein and mRNA levels of Hnf1B in Min6 cells；B:Changes in protein and mRNA levels of Hnf1B in primary islet cells；C:Effects on insulin secretion in Min6 cells；D:Effects on insulin secretion in primary islet cells（±s，n＝3）*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

3.6 miR-802靶向Hnf1B抑制胰島β細(xì)胞分泌胰島素

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-802是否通過靶向Hnf1B調(diào)控胰島素的分泌，在Min6細(xì)胞和胰島原代細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-802類似物和Hnf1B過表達(dá)載體，結(jié)果如圖6-A和6-B顯示，與單轉(zhuǎn)染miR-802類似物組相比，共轉(zhuǎn)染Hnf1B和miR-802類似物組可回復(fù)miR-802降低的胰島素分泌能力，以上結(jié)果表明miR-802是通過靶向Hnf1B抑制胰島素分泌。

Figure 6 MiR-802 targeting Hnf1B regulates the secretion of isletβcells.Co-transfected miR-802 mimics and Hnf1B in Min6 and primary islet cells for 48 h（xˉ±s，n＝3）A:Insulin secretion in Min6 cells；B:Insulin secretion in primary islet cells**P＜0.001

4 討 論

肝細(xì)胞核因子 1α（Hnf1A）和 Hnf1B（或vHNF1）是在肝、腎、腸道和胰腺β細(xì)胞中表達(dá)的密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子［13］。其最初被發(fā)現(xiàn)為單基因糖尿病基因，臨床特征包括胰腺發(fā)育不全和外分泌功能不全。來自動物模型的數(shù)據(jù)表明，Hnf1B對于胰腺和肝臟發(fā)育的多個階段至關(guān)重要［14］。Hnf1B的分子改變與多器官疾病有關(guān)［15-16］，包括5歲以下兒童的成熟期糖尿?。∕ODY5，HNF1β-MODY）［17-18］，外分泌胰腺的形態(tài)和功能異常［19］。另有研究表明Hnf1B突變攜帶者具有高胰島素血癥并伴有胰島素抵抗［20］。新近研究顯示Hnf1B通過調(diào)控PPARγ信號通路參與調(diào)控胰島素抵抗［15］，以上研究均說明Hnf1B可能參與胰島β細(xì)胞功能的調(diào)控。同時，Hnf1B可能與PAX6啟動子結(jié)合，直接控制 PAX6的表達(dá)［21］，許多證據(jù)表明，PAX6的任何改變（過度表達(dá)和限制性表達(dá)）均能對血糖產(chǎn)生影響，從而參與了糖尿病的發(fā)生與發(fā)展。PAX6有望成為治療糖尿病的新的發(fā)展方向［22］，也為進(jìn)一步深入研究提供新的依據(jù)。

本次研究通過在Min6細(xì)胞和胰島原代細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 miR-802的模擬物和抑制劑，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-802會抑制胰島β細(xì)胞胰島素的分泌，利用生物信息學(xué)預(yù)測并經(jīng)過雙熒光素酶報告系統(tǒng)、Western blot等實(shí)驗(yàn)確證了Hnf1B是miR-802的靶基因；最后通過功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)證明了miR-802是通過靶向Hnf1B，從而抑制胰島素分泌。本研究首次闡明了miR-802可以參與胰島β細(xì)胞功能的調(diào)控，初步探討其調(diào)控機(jī)制，為糖尿病的發(fā)生發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)。