宮田嬌 張 月 李 雪 朱興友 周成利 劉雋彥 樸玉蘭*

(1.吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院，吉林吉林 132012；2. 德惠市水稻生產(chǎn)工作站，吉林德惠 130300)

柞蠶屬食療同源昆蟲，我國(guó)養(yǎng)殖利用柞蠶已有2 000多年，柞蠶是我國(guó)重要的生物資源[1]。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是一個(gè)巨大的跨膜糖蛋白，屬受體型酪氨酸激酶，分子量約170 KDa的糖蛋白。整個(gè)受體分子可分為三個(gè)區(qū)域，胞內(nèi)區(qū)也稱羧基端區(qū)域，含542個(gè)氨基酸殘基，跨膜區(qū)由26個(gè)偏疏水氨基酸組成，胞外區(qū)也稱氨基端區(qū)域，含621個(gè)氨基酸殘基[2-4]。EGF自身或與其他生長(zhǎng)因子結(jié)合，可以激活EGFR產(chǎn)生許多生物應(yīng)答，包括細(xì)胞增殖、分化和遷移且EGF/EGFR信號(hào)在正常發(fā)育階段和創(chuàng)傷愈合等病理生理上的組織修復(fù)均有調(diào)節(jié)作用[5]。EGF可用于治療燒傷創(chuàng)面及牙周炎[6]，EGF及其受體在成年人多個(gè)腫瘤中起抑制作用[7]，在肝再生和創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程有促進(jìn)作用，對(duì)生殖系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用。EGF還可治療眼科角膜損傷、外傷性皮膚潰瘍、口腔潰瘍、胃腸道潰瘍、神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及鱗狀細(xì)胞癌等多種疾病[8]。李克動(dòng)對(duì)家蠶表皮生長(zhǎng)因子基因cDNA的克隆及表達(dá)特征進(jìn)行分析[9]。我國(guó)柞蠶資源存量豐富，其加工和綜合利用水平不斷提高，但對(duì)于柞蠶表皮生長(zhǎng)因子受體(ApEGFR)的研究還比較缺乏。

本研究從NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得家蠶表皮生長(zhǎng)因子受體(BmEGFR)基因序列，我們?cè)O(shè)計(jì)8對(duì)針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體基因的特異性引物，對(duì)該基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，采用熒光定量PCR方法檢測(cè)分析柞蠶不同期齡和不同組織中表皮生長(zhǎng)因子的基因表達(dá)程度。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

供試柞蠶品種為永青，由吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院保育飼養(yǎng)。取不同齡期的柞蠶樣品，分別為1齡柞蠶﹑1眠期柞蠶﹑2齡柞蠶﹑2眠期柞蠶﹑3齡柞蠶﹑3眠期柞蠶﹑4齡柞蠶﹑4眠期柞蠶﹑5齡柞蠶﹑蠶蛹﹑蠶蛾等等。將5齡柞蠶進(jìn)行解剖，取了組織樣品，組織樣品分別為柞蠶表皮﹑中腸﹑絲腺﹑脂肪體等。所取的材料均被放入-80 ℃冰箱保存。

TRIzol Reagent購(gòu)自Ambion公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司；瓊脂糖Agarose購(gòu)自Invitrogen；MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶﹑dNTP﹑DNAmarker﹑STAR HS DNA Polymerase with GC Buffer﹑PrimeScriptTMRT reagent Kit(for real time﹑ SYBR?PremixExTaqTMII (TliRNaseH Plus)等購(gòu)自Takara公司；DEPC購(gòu)自sigma公司；引物由華大基因科技有限公司合成。

1.2 生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得家蠶表皮生長(zhǎng)因子受體(BmEGFR)基因序列，采用在線軟件primer 3(https://www.yeastgenome.org/primer3)設(shè)計(jì)引物。采用在線軟件SIM(https://web.expasy.org/sim/)對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3 柞蠶總RNA的提取及cDNA合成

各齡期柞蠶和組織樣品總RNA的提取按照Trizol試劑盒(Ambion公司產(chǎn)品)說(shuō)明書分別提取。分別取各組織總RNA 1.0 μg，利用cDNA第一條鏈合成試劑盒，以O(shè)ligo-dT為引物，反轉(zhuǎn)錄為cDNA樣本。準(zhǔn)備試劑過(guò)程均在冰上操作。反應(yīng)體系如下：5X RT buffer 4 μL; Reversetranscriptate 1 μL; dNTPMixture (10mM) 2 μL; 0.1 M DTT 2 μL; OligoDT(0.18μg/μL) 2.5 μL; Protector RNase Inhibitor(40u/μL) 1 μL; Total RNA 1 μg。將上述反應(yīng)體系混合后，按以下程序進(jìn)行反應(yīng)：25 ℃，10 min；55 ℃，30 min； 85 ℃，5 min；冰上終止反應(yīng)。反應(yīng)完成后，cDNA 樣本-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增

根據(jù)已經(jīng)在線公布的家蠶基因組精細(xì)圖譜與從NCBI等公共數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的序列信息，我們?cè)O(shè)計(jì)了8對(duì)針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體基因的特異性引物(表2)。根據(jù)BmEGFR基因序列設(shè)計(jì)的引物，柞蠶的cDNA為模板，進(jìn)行了PCR，PCR反應(yīng)體系如下：5X Green GoTaq Flexi buffer10 μL; MgCl2 solution 4 μL; dNTP(10mM) 4 μL; Primer F1/R1 2.5 μL;Taq polymerase 0.5 μL; Template 1 μL；H2O 28 μL。擴(kuò)增條件:94 ℃ 2 min； 95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 S，72 ℃ 1 min，30循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.5 熒光定量PCR檢測(cè)

根據(jù)已獲得的家蠶表皮生長(zhǎng)因子受體基因部分序列，設(shè)計(jì)了熒光定量PCR引物(Forward：GTGGTATGGCATACTTGGAAGAG；Reverse：ACCTCCAGCTGCTTTATACTCATC)。內(nèi)參基因引物( Forward：AAGTCATCACAATCGGGAACG；Reverse：GGAGTTGTAAGTCGCTCGTGG)根據(jù)柞蠶的Actin基因設(shè)計(jì)。熒光定量PCR反應(yīng)體系：50 μL反應(yīng)體系中加入25 μL2×HotstartFluo-PCR mix，1 μL primers，0.5 μL probe，1 μL模板，21.5 μL DEPC水，利用熒光定量PCR。熒光定量PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 S；60 ℃ 30 S；40循環(huán)。在40個(gè)循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后Ct值將被讀取，最后熔解曲線分析隨之進(jìn)行。通過(guò)相對(duì)定量分析法，分析相關(guān)數(shù)據(jù)，檢測(cè)其在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)差異。每個(gè)樣品均有3個(gè)重復(fù)樣，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)果與分析

3.1 各齡期柞蠶總RNA的檢測(cè)

因未知不同時(shí)期柞蠶的表皮生長(zhǎng)因子的基因表達(dá)程度，取1-5齡柞蠶為樣品，提取總RNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖1)，檢測(cè)其RNA的純度及濃度(表1)，合成 cDNA。圖1可以看出提取的總RNA沒(méi)有DNA基因組DNA的污染，純度較高；表1可見所檢測(cè)的各個(gè)齡期總RNA的A260/A280數(shù)值都約為2.0左右，所提取到的總RNA濃度較高。

3.2 柞蠶表皮生長(zhǎng)因子受體(ApEGFR)的部分基因序列

根據(jù)已經(jīng)在線公布的家蠶基因組精細(xì)圖譜與從NCBI等公共數(shù)據(jù)庫(kù)獲取家蠶表皮生長(zhǎng)因子受體(BmEGFR)基因序列信息。BmEGFR基因全長(zhǎng)為4 350 bp，具有1 449個(gè)氨基酸，MW為161.3 kDa，等電點(diǎn)(PI)為5.85。根據(jù)BmEGFR基因序列，我們?cè)O(shè)計(jì)了8對(duì)針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體基因的特異性引物(表2)。BM-EGFR-S1/BM-EGFR-AS1引物是BmEGFR基因兩端設(shè)計(jì)的引物，以柞蠶cDNA為模板PCR擴(kuò)增中沒(méi)有出現(xiàn)條帶，未獲取柞蠶表皮生長(zhǎng)因子的全長(zhǎng)序列。但這8對(duì)引物中BM-EGFR-S3/BM-EGFR-AS3引物在5齡柞蠶cDNA為模板的PCR擴(kuò)增中出現(xiàn)細(xì)微的條帶(圖2-A)，直接利用這條帶PCR產(chǎn)物作為模板，再次進(jìn)行PCR，在500 bp左右處出現(xiàn)明顯的條帶(圖2-B)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與BmEGFR基因做了比對(duì)，比對(duì)結(jié)果ApEGFR的部分基因序列與BmEGFR的2677-3163基因序列有81.7%序列重合(圖3)。

M—DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1—1齡柞蠶；2—2齡柞蠶；3—3齡柞蠶；4—4齡柞蠶；5—5齡柞蠶

圖1 RNA 電泳圖

表1 RNA提取純度及濃度

A.8對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；B.BM-EGFR-S3/BM-EGFR-AS3引物進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 柞蠶表皮生長(zhǎng)因子受體的部分cDNA的PCR產(chǎn)物

表2 PCR 引物

3.3 不同發(fā)育階段中ApEGFR基因的表達(dá)差異

為了研究柞蠶表皮生長(zhǎng)因子受體的發(fā)生規(guī)律，取了不同齡期柞蠶樣品(1齡柞蠶﹑2齡柞蠶﹑3齡柞蠶﹑4齡柞蠶﹑5齡柞蠶﹑1眠期﹑2眠期﹑3眠期﹑4眠期﹑蛹﹑蛾等)，分離提取RNA后合成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)不同發(fā)育階段中 ApEGFR基因的表達(dá)差異。結(jié)果如圖4所示：不同發(fā)育階段的柞蠶中，2齡柞蠶的ApEGFR基因的mRNA 表達(dá)量比1齡柞蠶稍微降低，但3齡開始又組逐漸上升，5齡的時(shí)候ApEGFR的mRNA 的表達(dá)量最高，在蠶蛹和蠶蛾體內(nèi)的ApEGFR基因的mRNA表達(dá)量就明顯下降(圖4-A)。柞蠶的整個(gè)眠期中，2眠期的表達(dá)量比1眠期降低，2眠期過(guò)后ApEGFR的mRNA 的表達(dá)量逐漸上升，到3眠期時(shí)ApEGFR基因的mRNA表達(dá)量為最高， 4眠期的時(shí)候表大量顯著降低(圖4-B)。同樣的方法對(duì)5齡柞蠶的表皮﹑絲腺﹑脂肪體﹑中腸等不同組織，進(jìn)行檢測(cè)ApEGFR基因的表達(dá)程度。結(jié)果如圖4-C所示，在柞蠶的絲腺中表達(dá)量最高，說(shuō)明ApEGFR基因的表達(dá)主要集中在絲腺中，絲腺是該基因的重要的表達(dá)場(chǎng)所。中腸表達(dá)量次之，但對(duì)比絲腺表達(dá)量差異大，蠶表皮和脂肪中表達(dá)量極少。

4 結(jié) 論

柞蠶渾身是寶，其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多種人體所必須的氨基酸，廣泛用于保健食品和醫(yī)藥工業(yè)。對(duì)柞蠶營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的相關(guān)報(bào)道較多，但關(guān)于柞蠶表皮生長(zhǎng)因子的研究與報(bào)道比較少。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的8對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體基因的特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，BM-EGFR-S3/BM-EGFR-AS3引物在5齡柞蠶cDNA為模板的PCR擴(kuò)增中出現(xiàn)細(xì)微的條帶，以這條帶PCR產(chǎn)物為模板，再次進(jìn)行PCR，在500 bp左右處出現(xiàn)明顯的條帶。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與家蠶表皮生長(zhǎng)因子受體(BmEGFR)基因做了比對(duì)，比對(duì)結(jié)果ApEGFR的部分基因序列與BmEGFR的2677-3163基因序列有81.7%序列重合。

同時(shí)為了研究柞蠶表皮生長(zhǎng)因子受體的發(fā)生規(guī)律，選取了柞蠶不同的齡期和組織，進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)不同發(fā)育階段中ApEGFR基因的表達(dá)差異。結(jié)果表明不同發(fā)育階段和整個(gè)眠期的柞蠶中，ApEGFR的mRNA均有表達(dá)，但在5齡和3眠期的時(shí)候的表達(dá)量最高。不同組織中，在柞蠶的絲腺中ApEGFR的mRNA表達(dá)量最高，表皮最低。該實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究表皮生長(zhǎng)因子受體的作用提供了選擇依據(jù)。