李亦軒 江帥菲 董明亮 齊帥征 張金鳳

(林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083)

油松(PinustabulaeformisC.)為松科針葉常綠喬木，是我國(guó)特有的樹種，也是我國(guó)華北、東北等地區(qū)主要的造林樹種和用材樹種。油松用途廣泛，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，生態(tài)價(jià)值和觀賞價(jià)值；并且油松抗瘠薄、抗風(fēng)，適應(yīng)惡劣環(huán)境的能力強(qiáng)，在我國(guó)的生態(tài)建設(shè)中發(fā)揮了非常重要的作用[1]。但是，到目前為止，油松的繁殖效率還很低，存在生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、有性繁殖后代變異較大、扦插等無性繁殖生根率低等問題；同時(shí)，蟲害和各種疾病又造成了油松種子產(chǎn)量的下降。因此，需要一種新方法來提高油松優(yōu)良材料的繁殖效率。

體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)是一種大規(guī)模繁殖的有效方法[2]，外植體在特定條件下，未經(jīng)性細(xì)胞融合而是經(jīng)過了一個(gè)與合子胚胎發(fā)生類似的過程，發(fā)育形成具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)的過程[3]。體細(xì)胞胚胎發(fā)生可以作為大規(guī)模繁殖的有效方法，特別是對(duì)于使用常規(guī)無性繁殖難以繁殖的優(yōu)良基因型[2]。與其他傳統(tǒng)的繁育方法相比，體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)具有繁殖速度快、數(shù)量多、不受季節(jié)影響、優(yōu)良性狀后代能夠穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)[4]。體細(xì)胞胚的成熟是體胚發(fā)生體系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，許多因素直接影響細(xì)胞的分化，進(jìn)而影響體胚的產(chǎn)生。因此，篩選和優(yōu)化油松體細(xì)胞胚成熟過程的影響因素尤為重要。

以現(xiàn)有的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，油松胚性愈傷組織成胚率低，而在一些愈傷組織中甚至沒有體胚的產(chǎn)生。為了最大程度發(fā)揮油松胚性愈傷的胚性，提高體胚的數(shù)量和質(zhì)量，本研究對(duì)現(xiàn)有的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了調(diào)整和優(yōu)化，以油松胚性愈傷組織為試驗(yàn)材料，研究了成熟培養(yǎng)基中ABA質(zhì)量濃度、PEG質(zhì)量濃度、植物凝膠質(zhì)量濃度、麥芽糖和蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)于體胚數(shù)量的影響，同時(shí)以成熟率對(duì)現(xiàn)有的培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，希望能夠篩選出最優(yōu)的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳的培養(yǎng)條件以提高油松體細(xì)胞胚成熟率，為油松的高效繁殖奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以本實(shí)驗(yàn)室前期積累的胚性細(xì)胞系為材料[5]，選擇增殖能力強(qiáng)，胚性比較好的胚性細(xì)胞系15c4b，16c4a等,見圖1。

圖1 油松胚性愈傷組織

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基礎(chǔ)固體成熟培養(yǎng)基

使用針葉樹基礎(chǔ)培養(yǎng)基[6]，并添加酶水解酪蛋白0.5 g·L-1，pH調(diào)至5.8，谷氨酰胺0.5 g·L-1(過濾滅菌后加入)，含ABA 8 mg·L-1、PEG4000質(zhì)量濃度50 g·L-1、植物凝膠3 g·L-1、蔗糖30 g·L-1。

1.2.2固體成熟培養(yǎng)基中4種影響因素水平的設(shè)置

成熟培養(yǎng)基中ABA質(zhì)量濃度分別設(shè)置為6、10、14、18、22 mg·L-1；PEG4000質(zhì)量濃度分別設(shè)置為25、50、75、100、125 g·L-1；在成熟培養(yǎng)基中依次添加1.5(能使培養(yǎng)基凝固的最少含量)、2.0、2.5、5.0、7.5 g·L-1的植物凝膠；在成熟培養(yǎng)基中添加麥芽糖和蔗糖兩類糖，其質(zhì)量濃度組合分別為：0+40、12.5+27.5、15+25、22.5+17.5、40+0 g·L-1，用裝有剪去尖端槍頭的移液槍吸取等量的懸浮愈傷組織噴撒在固體成熟培養(yǎng)基表面，吸去多余水分，在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)7～8周后統(tǒng)計(jì)體胚的數(shù)量，每個(gè)單因素試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 正交設(shè)計(jì)與驗(yàn)證

利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以ABA質(zhì)量濃度、PEG質(zhì)量濃度、植物凝膠質(zhì)量濃度、糖的種類和質(zhì)量濃度4個(gè)因素的單因素分析最優(yōu)結(jié)果為中心值，上下各挑選1個(gè)梯度值共3個(gè)水平，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)開展試驗(yàn)，選出最優(yōu)組合，試驗(yàn)重復(fù)3次。

為了驗(yàn)證調(diào)整后的培養(yǎng)基的成胚效果，7～8周后分別統(tǒng)計(jì)原培養(yǎng)基與調(diào)整后的培養(yǎng)基體胚的數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

培養(yǎng)7～8周以后，對(duì)每盤體胚的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用Microsoft Excel和SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用最小顯著極差法(LSD)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟培養(yǎng)基中ABA、PEG、植物凝膠和糖類對(duì)體胚數(shù)量的影響

從表1中可以看出隨著成熟培養(yǎng)基中ABA質(zhì)量濃度的增加，體胚的數(shù)量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，當(dāng)增加到一定濃度的時(shí)候，體胚的數(shù)量呈下降的趨勢(shì)。綜合來看，成熟培養(yǎng)基中ABA質(zhì)量濃度為14～18 mg·L-1時(shí)，其誘導(dǎo)體胚的效果顯著，尤其在18 mg·L-1時(shí)，體胚的數(shù)量最高。

當(dāng)成熟培養(yǎng)基中PEG的質(zhì)量濃度為25 g·L-1時(shí)，體細(xì)胞胚的數(shù)量較低，隨著PEG質(zhì)量濃度的升高，體胚的數(shù)量明顯上升，在PEG濃度為50～100 g·L-1時(shí)，成胚的效果最明顯。綜合來看，培養(yǎng)基中添加75 g·L-1PEG時(shí)，獲得的體胚的數(shù)量最高。

隨著植物凝膠含量的增加，體細(xì)胞胚的數(shù)量呈逐漸升高的趨勢(shì)，當(dāng)植物凝膠為7.5 g·L-1時(shí)，體胚的數(shù)量下降。綜合來看，成熟培養(yǎng)基中植物凝膠質(zhì)量濃度為2.5～5.0 g·L-1時(shí)，對(duì)體胚的形成影響最好，在植物凝膠濃度為5.0 g·L-1時(shí)，體胚的數(shù)量最高。

從表1中結(jié)果可得知隨著麥芽糖和蔗糖質(zhì)量濃度的變化，體胚的數(shù)量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；當(dāng)增加到一定濃度時(shí)，體胚的數(shù)量有所下降；綜合來看，當(dāng)成熟培養(yǎng)基中麥芽糖和蔗糖質(zhì)量濃度為(15+25)g·L-1，對(duì)成胚的效果較好。

表1 不同質(zhì)量濃度ABA、PEG、植物凝膠和糖類對(duì)體胚數(shù)量的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述結(jié)果，選出4個(gè)因素最優(yōu)范圍內(nèi)3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，7～8周后愈傷組織產(chǎn)生體胚的數(shù)量如表2和表3所示。2號(hào)處理組產(chǎn)生體胚的數(shù)量最多，平均每克胚性愈傷組織可以得到35.6個(gè)體胚；9號(hào)處理組獲得的體胚數(shù)量最低，僅為12個(gè)。極差分析顯示，本試驗(yàn)最優(yōu)組合為ABA質(zhì)量濃度為16 mg·L-1，PEG質(zhì)量濃度為75 g·L-1，植物凝膠質(zhì)量濃度為5 g·L-1，麥芽糖和蔗糖質(zhì)量濃度為10+30 g·L-1。方差分析(表4)的結(jié)果顯示，在0.05水平下，ABA、PEG、植物凝膠和糖類配比對(duì)成熟體細(xì)胞胚的數(shù)量具有顯著影響，其中ABA影響最為顯著，其次為PEG、糖類；植物凝膠影響不顯著。

表2 ABA、PEG、植物凝膠和糖類對(duì)體胚數(shù)量影響的正交試驗(yàn)結(jié)果

編號(hào)ABA質(zhì)量濃度/mg·L-1PEG質(zhì)量濃度/g·L-1凝膠質(zhì)量濃度/g·L-1麥芽糖+蔗糖質(zhì)量濃度/g·L-1體胚數(shù)量/個(gè)·g-1116603.010+3030.0±2.86216755.015+2535.6±6.79316907.020+2014.0±1.24418605.020+2017.3±1.69518757.010+3026.3±4.10618903.015+2515.0±2.94720607.015+2514.0±5.01820753.020+2015.0±6.16920905.010+3012.0±2.49

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.3 優(yōu)化培養(yǎng)基驗(yàn)證

從圖2和圖3中可以看出隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，體胚的數(shù)量也逐漸增加，調(diào)整后的培養(yǎng)基體胚的數(shù)量明顯大于原培養(yǎng)基中體胚的數(shù)量，在第9周，優(yōu)化培養(yǎng)基上體胚數(shù)量可達(dá)51個(gè)/g，原培養(yǎng)基為27個(gè)/g，提高了0.8倍。另外，與原培養(yǎng)基相比，調(diào)整后的培養(yǎng)基上出現(xiàn)體胚的時(shí)間較早，從第5周就出現(xiàn)體胚，且體胚增加速度更快，所以調(diào)整后的成熟培養(yǎng)基成分更有利于體胚的產(chǎn)生。

表3 ABA、PEG、植物凝膠和糖類對(duì)體胚數(shù)量影響的正交試驗(yàn)極差分析

指標(biāo)各因素不同梯度時(shí)測(cè)定的體胚數(shù)量/個(gè)·g-1ABA質(zhì)量濃度PEG質(zhì)量濃度凝膠質(zhì)量濃度麥芽糖+蔗糖質(zhì)量濃度K126.520.4320.022.76K219.525.6321.621.53K313.613.6018.115.43R12.912.033.57.33

注：最優(yōu)組合為ABA質(zhì)量濃度為16 mg·L-1、PEG質(zhì)量濃度為75 g·L-1、植物凝膠質(zhì)量濃度為5 g·L-1、麥+蔗糖質(zhì)量濃度為(10+30)g·L-1。

表4 油松體胚成熟培養(yǎng)基試驗(yàn)方差分析

注：*表示在P<0.05水平差異顯著。

A.成熟培養(yǎng)基中體細(xì)胞胚生長(zhǎng)狀態(tài)；黑色箭頭表示油松體細(xì)胞胚；B.體式顯微鏡下觀察到的成熟培養(yǎng)基體細(xì)胞胚狀態(tài)，箭頭表示胚柄和胚頭。

圖2 油松體細(xì)胞胚生長(zhǎng)狀態(tài)

圖3 培養(yǎng)基調(diào)整前后體胚數(shù)量的統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論與討論

油松體細(xì)胞胚胎發(fā)生是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的過程，其中成熟階段是最為重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，受到許多因素的影響，例如成熟培養(yǎng)基的成分，培養(yǎng)環(huán)境的溫度，外源激素的種類與濃度，繼代周期的長(zhǎng)短，細(xì)胞系的胚性以及母樹基因型來源等[7]。本文探究了ABA質(zhì)量濃度、PEG質(zhì)量濃度、植物凝膠及糖的種類和質(zhì)量濃度對(duì)油松體細(xì)胞胚成熟率的影響。

油松細(xì)胞系在增殖過程中，培養(yǎng)基上殘留的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2,4-D和6-BA對(duì)成熟階段體細(xì)胞胚的產(chǎn)生會(huì)造成影響[8]，所以油松愈傷組織材料在進(jìn)入成熟培養(yǎng)之前，要先進(jìn)行預(yù)處理，其目的就是除去材料上吸附的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。本試驗(yàn)采用懸浮培養(yǎng)的方式處理試驗(yàn)材料，除了提高植物材料的利用率以外，也能夠使材料與液體培養(yǎng)基充分接觸。

ABA在許多物種體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中起到非常重要的作用，尤其是針葉樹[9]。已經(jīng)有研究證明，在成熟培養(yǎng)基中添加適量濃度的ABA能夠顯著提高胚性愈傷組織成胚率和質(zhì)量[10]，杜克久等在山茶花體胚發(fā)生體系的研究中，添加ABA后山茶花體胚可達(dá)70-75%[11]。在其他有關(guān)針葉樹體胚成熟的研究中，宋躍等報(bào)道了有關(guān)長(zhǎng)白落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生的初步結(jié)果，結(jié)果表明ABA的質(zhì)量濃度和滲透壓的改變，對(duì)落葉松體細(xì)胞胚的影響顯著，最佳數(shù)量可達(dá)(204±4)g-1[12]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明在探索影響成熟階段體細(xì)胞胚胎發(fā)生的幾個(gè)因素中，ABA對(duì)其成胚的影響最為顯著。ABA在外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，能夠減少植物組織產(chǎn)生的裂生多胚的數(shù)量，使組織胚胎分散成單個(gè)胚，即起到了使胚從增殖生長(zhǎng)狀態(tài)向成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變的作用[13]。適宜的ABA能夠改善愈傷組織的狀態(tài)，使其結(jié)構(gòu)細(xì)密，逐漸失水保持干燥[14]，提高體細(xì)胞胚的質(zhì)量，減少畸形胚，提高成胚率[15]，這可能與體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中一些特定表達(dá)的基因有關(guān)[16]。

針葉樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生也受碳水化合物的類型和濃度的影響[17-18]。在華北落葉松的體細(xì)胞胚胎發(fā)生的過程中，蔗糖的質(zhì)量濃度會(huì)顯著影響體細(xì)胞胚的質(zhì)量和數(shù)量[19]；云杉的體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中，過高濃度的蔗糖不利于體細(xì)胞胚的發(fā)生[18]；與蔗糖相比，麥芽糖更有利于火炬松體細(xì)胞胚胎的發(fā)生[20]，用麥芽糖代替蔗糖，不僅顯著提高了體細(xì)胞胚成熟率,而且使體細(xì)胞胚發(fā)生時(shí)間提前一周；與蔗糖相比，在麥芽糖中體細(xì)胞胚質(zhì)量明顯改善，體細(xì)胞胚體積小，大小均一，畸形胚很少[21]。本研究中可以看到，與同時(shí)含有麥芽糖和蔗糖的處理組相比，單只含有一種糖類的處理組得到的成熟體細(xì)胞胚的數(shù)量小于前者，這說明在體細(xì)胞胚胎成熟過程中，同時(shí)添加麥芽糖和蔗糖有利于體細(xì)胞胚數(shù)量的提高。麥芽糖除了提供體胚發(fā)生過程中的碳源和能量外，也會(huì)對(duì)體細(xì)胞胚胚柄的生長(zhǎng)有一定程度的抑制作用[17]；在只含蔗糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)胚柄過度生長(zhǎng)，抑制胚頭的生長(zhǎng)發(fā)育等現(xiàn)象，造成體細(xì)胞胚畸形，甚至死亡，最終降低成胚率，用麥芽糖代替蔗糖時(shí)，這種現(xiàn)象的發(fā)生率降低[17，22]。

已有的研究表明PEG對(duì)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓，且經(jīng)PEG處理的愈傷組織細(xì)胞的活力和有絲分裂能力均較高，有利于后續(xù)成熟培養(yǎng)[23]。齊力旺等對(duì)華北落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究發(fā)現(xiàn)，添加75 g·L-1PEG4000每克愈傷組織得到82.7個(gè)子葉胚[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，PEG4000濃度過高或過低都會(huì)影響體胚的數(shù)量，PEG4000在75 g·L-1時(shí)體胚數(shù)量最多。以上結(jié)果說明在針葉樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

植物凝膠的含量多少對(duì)培養(yǎng)基的軟硬程度有影響。當(dāng)含量過多時(shí)，培養(yǎng)基過于堅(jiān)硬，不僅會(huì)影響胚性愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)，組織表面干化，呈結(jié)晶狀，影響組織轉(zhuǎn)向成熟狀態(tài)的發(fā)育，而且會(huì)影響體細(xì)胞胚的形態(tài)和生長(zhǎng)狀況；而植物凝膠含量過少時(shí)，胚性愈傷組織周圍會(huì)有水份堆積，也會(huì)影響其胚性的發(fā)展。但是本研究發(fā)現(xiàn)，植物凝膠對(duì)油松體細(xì)胞胚的影響不顯著，已有的研究，也未發(fā)現(xiàn)植物凝膠對(duì)油松愈傷組織有顯著影響[5]，這與本研究結(jié)論一致。

針葉樹的體細(xì)胞胚胎發(fā)生的成熟階段是比較困難的，在愈傷組織增殖的過程中由于繼代時(shí)間長(zhǎng)，機(jī)械損傷等原因會(huì)造成胚性的喪失。不同的基因型細(xì)胞系的胚性也不盡相同，所以在成熟培養(yǎng)階段，要根據(jù)細(xì)胞系的胚性狀況，合理的調(diào)節(jié)和改進(jìn)成熟培養(yǎng)基的成分，一般可以得到較好的效果，為了選著出最適的成分配比本研究在單因素分析的基礎(chǔ)上開展了正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)及驗(yàn)證，當(dāng)ABA質(zhì)量濃度14～18 mg·L-1、PEG質(zhì)量濃度為50～100 g·L-1、植物凝膠質(zhì)量濃度為2.5～5.0 g·L-1、麥芽糖和蔗糖質(zhì)量濃度為(15+25)g·L-1時(shí)，進(jìn)一步提高了體胚的成熟率，為油松的大規(guī)模繁殖提供了技術(shù)基礎(chǔ)，并為后續(xù)油松基因工程遺傳轉(zhuǎn)化，提供了材料和技術(shù)平臺(tái)。