劉麗娜 徐玉娟 肖更生 吳繼軍 余元善 傅曼琴

摘要：【目的】研究不同貯藏年份陳皮中黃酮類物質(zhì)及其抗氧化活性的差異，為陳皮的品質(zhì)鑒定及調(diào)控提供參考依據(jù)。【方法】以貯藏1年（2017年產(chǎn)）、5年（2013年產(chǎn)）和15年（2003年產(chǎn)）的新會陳皮為研究對象，采用乙醇超聲法提取陳皮總黃酮，高效液相色譜法（HPLC）分析總黃酮成分，并采用2，2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）銨鹽（ABTS）、FRAP（鐵離子還原/抗氧化能力）和DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）法評價陳皮總黃酮的抗氧化活性?！窘Y果】貯藏15年間，陳皮總黃酮含量從3.93±0.07 mg RE/g顯著增加到6.66±0.12 mg RE/g（P<0.05，下同），增長率為69.47%;不同年份陳皮總黃酮的ABTS、FRAP和DPPH值均呈增長趨勢，且年份間差異顯著，以ABTS值最大，其次是FRAP值，DPPH值最小。橙皮苷、川陳皮素和桔皮素的保留時間分別為7.8、17.7和19.4 min，且3種主要黃酮類物質(zhì)成分含量隨陳皮貯藏時間的延長顯著增加，其中橙皮苷含量在15年間增加2.61倍，川陳皮素含量增加62.74%，桔皮素含量增加了55.50%;在貯藏1年和5年的陳皮中，3種主要黃酮類物質(zhì)含量排序為川陳皮素>桔皮素>橙皮苷;而在15年陳皮中，其含量排序為橙皮苷>川陳皮素>桔皮素?！窘Y論】隨著陳皮貯藏時間的延長，其總黃酮含量顯著增加，抗氧化能力增強，橙皮苷、川陳皮素和桔皮素3種主要的黃酮類物質(zhì)含量遞增。這一變化規(guī)律可為闡釋陳皮“陳久者良”的科學內(nèi)涵提供理論依據(jù)，對研究陳皮陳化品質(zhì)的形成及其調(diào)控具有參考價值。

關鍵詞： 陳皮;黃酮;貯藏年份;抗氧化;高效液相色譜法

0 引言

【研究意義】陳皮（Pericarpium Citri Reticulatae，PCR）是蕓香科植物橘（Citrus reticulate Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮（陳琳等，2015），是廣東道地藥材，位居“廣東三寶”之首?！督B興本草》曾報道“唯橘皮以陳久者佳”，中醫(yī)理論也認為隨著陳皮貯藏年限的增加，其藥用價值更高（國家藥典委員會，2015）。陳皮中含有黃酮類化合物、揮發(fā)油類、檸檬苦素類、生物堿類、礦物質(zhì)元素及其他營養(yǎng)物質(zhì)（歐立娟和劉啟德，2006），其中黃酮類化合物具有清除自由基、保護心血管和抗腫瘤等功效（閆文莉，2018）。因此，對不同貯藏年份陳皮進行黃酮成分分析及其活性評價，對于闡釋陳皮“陳久者良”的科學內(nèi)涵具有一定的意義。【前人研究進展】目前的研究主要從不同貯藏年限陳皮化學成分的變化及其影響因素探索等方面對陳皮“陳久者良”進行科學闡釋（王福等，2015）。易倫朝等（2005）通過高效液相色譜—二極管陣列檢測（HPLC-DAD）技術對不同年份的陳皮樣品精油及黃酮類成分進行分析，結果表明不同年份及不同處理的陳皮黃酮類物質(zhì)無明顯變化。鄭國棟等（2010）用HPLC對10批不同貯藏年限廣陳皮藥材中的橙皮苷、川陳皮素、橘皮素等5種黃酮類成分的變化規(guī)律進行定量研究，結果表明所選原料中橙皮苷含量均符合國家藥典標準（≥35 mg/g），且5種黃酮類物質(zhì)含量隨貯藏時間延長均呈增加趨勢。魏瑩等（2016）在不同色譜條件下建立了一種測定不同貯存年限（1～19年）廣陳皮藥材中橙皮苷、川陳皮素、桔皮素和辛弗林含量的HPLC，該方法操作簡便、穩(wěn)定、重復性好，并推測陳皮“陳久者良”可能與上述4種活性成分含量變化無關，與其揮發(fā)油含量減少而緩和燥性有關。Fu等（2017）使用HPLC和雙波長檢測同時測定橙皮苷和5種多甲氧基黃酮的含量，結果表明多甲氧基黃酮可用作評價陳皮存儲過程中質(zhì)量變化的指標，較長的儲存期可提高陳皮質(zhì)量;之后Fu等（2018）通過控制溫度和濕度交替儲存條件研究陳皮總黃酮、總多酚和多酚分布參數(shù)，結果表明，與自然環(huán)境條件相比，交替儲存條件加速陳皮褐變，增加酚類物質(zhì)損失，總多酚、總黃酮和橙皮苷含量下降，但5種多甲氧基黃酮和抗氧化活性在整個儲存期間均有所增加。段慶等（2019）通過HPLC測定11種不同貯藏年限的新會陳皮提取物中4種黃酮成分含量，并在11種陳皮樣品中均檢測到這4種黃酮類化合物，得到貯藏時間越長橙皮苷含量越高的結論，為陳皮“陳久者良”提供理論支撐。李文東等（2019）測定19個不同陳皮樣品中多甲氧基黃酮川陳皮素和桔皮素含量，結果測得二者含量分別為0.031%～0.968%和0.011%～0.546%，經(jīng)方法學驗證后表明不同品種來源陳皮中多甲氧基黃酮含量有明顯差異。【本研究切入點】近年來，在研究陳皮“陳久者良”科學依據(jù)的方向上雖然找到了一定依據(jù)，但并未明確不同貯藏年份陳皮主要黃酮類化合物的具體差異及陳皮貯藏時間對這些黃酮類化合物的影響。【擬解決的關鍵問題】以2017、2013和2003年產(chǎn)的新會陳皮為研究對象，探究不同貯藏年份陳皮黃酮成分與抗氧化活性的相關性及差異性，旨在進一步完善陳皮“陳久者良”的科學理論依據(jù)，為其品質(zhì)鑒定及調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

2017、2013和2003年產(chǎn)陳皮（對應分別貯藏1年、5年和15年）購自江門市新寶堂陳皮有限公司，均來自同一果園當年12月份所采茶枝柑的果皮。氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉和無水乙醇為分析純，甲醇為色譜純，均購自天津市大茂化學試劑廠;總抗氧化能力檢測試劑盒[鐵離子還原/抗氧化能力（FRAP）法和2，2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）銨鹽（ABTS）法]購自南京建成生物工程研究所;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、蘆丁、橙皮苷、川陳皮素、桔皮素和Trolox標準品均購自美國Sigma公司。

主要儀器設備：SQP電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司];RHP-100高速多功能粉碎機（浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司）;HWS-26電熱水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）;A-1000S水流抽氣機、N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）;VF204A真空抽濾機（美國圣斯特公司）;DL-800B智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）;JW-1042離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司）;Bio Tek Gen5酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）;UV1800紫外分光光度計、LC-20AT高效液相色譜儀[島津儀器（蘇州）有限公司]。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 黃酮提取物制備 將3個年份的陳皮樣品打粉，分別稱取陳皮粉95 g，按料液比1∶10加入90%乙醇提取，50 ℃恒溫水浴超聲波1 h，減壓抽濾后得到濾液和濾渣。對濾渣重復上述操作提取2次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至濃縮液體積約100 mL;濃縮液冷凍干燥得陳皮黃酮提取物，置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 總黃酮測定

1. 2. 2. 1 蘆丁標準曲線 使用90%乙醇溶解21.30 mg蘆丁標準品，并定容至100 mL，搖勻后得到蘆丁標準溶液濃度為0.2130 mg/mL。分別移取蘆丁標準溶液0、1、2、3、4、5、6和7 mL置于10 mL容量瓶中，并用90%乙醇定容至刻度線，再分別量取5 mL各濃度的蘆丁標準溶液于試管中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻后靜置5 min，加入1 mL 10%硝酸鋁溶液振蕩混合，靜置6 min，然后加入4 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，振蕩混勻，45 ℃恒溫水浴10 min，冷卻，5000 r/min離心5 min，取上清液在505 nm波長下測其吸光值（A），平行重復3次。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制標準曲線，所得線性回歸方程為y=4.7386x-0.003（R2=0.999）。

1. 2. 2. 2 黃酮提取物中總黃酮測定 分別稱取1.00 g不同年份的陳皮黃酮提取物，加入50 mL 90%乙醇超聲溶解、攪拌，得到黃酮提取液。分別取2017、2013和2003年的黃酮提取液4、2和1 mL置于10 mL容量瓶中，并用90%乙醇定容至刻度線，相當于稀釋2.5、5.0和10.0倍，然后加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置5 min后加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，振蕩混勻，靜置6 min，再加入4 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，振蕩均勻，45 ℃恒溫水浴10 min，冷卻，5000 r/min離心5 min，取上清液在505 nm波長下分別測其吸光值，最終的總黃酮含量以蘆丁當量（mg RE/g）表示，每種樣品平行重復3次。

每克提取物中黃酮含量（mg/g）=（A+0.03）×稀釋倍數(shù)×50/（4.7386×1）。

陳皮中總黃酮含量（mg/g）=提取物凍干后總質(zhì)量×每克提取物中黃酮含量/陳皮樣品總質(zhì)量。

1. 2. 3 總黃酮抗氧化能力測定

1. 2. 3. 1 ABTS法 用雙蒸水將Trolox標準液分別稀釋為0.1、0.2、0.4、0.8和1.0 mmol/L梯度溶液。按照ABTS試劑盒說明進行試驗，以標準品OD值為橫坐標、各OD值對應的標準品濃度為縱坐標繪制標準曲線。把樣品的OD值代入標準曲線，計算其對應的標準品濃度。最終的總抗氧化能力以當量Trolox溶液濃度表示。

1. 2. 3. 2 FRAP法 配制各濃度梯度（0.15、0.30、0.60、0.90、1.20和1.50 mmol/L）的硫酸亞鐵標準品溶液。按照FRAP試劑盒使用說明進行試驗，以標準品OD值為橫坐標、各OD值對應的標準品濃度為縱坐標繪制標準曲線。把樣品OD值代入標準曲線，計算其對應的標準品濃度。最終的總抗氧化能力用當量Trolox溶液濃度表示。

1. 2. 3. 3 DPPH法 稱量39.40 mg DPPH標準品，用適量90%乙醇溶解并定容至1 L，得到100 μmol/L的DPPH溶液，避光保存?zhèn)溆?。稱量10.00 mg Trolox標準品，用90%乙醇溶解并定容至100 mL，得到濃度為0.1 mg/mL的Trolox標準溶液。分別移取2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0 mL原液置于10 mL容量瓶中并用90%乙醇定容，得到一系列不同濃度梯度Trolox標準溶液。

試驗分為空白組、樣品組和對照組?？瞻捉M：以90%乙醇為空白對照（零管），取6 mL 90%乙醇室溫避光保存30 min。樣品組：5 mL 100 μmol/L DPPH溶液中加入1 mL Trolox標準液（樣液），搖勻，室溫下避光保存30 min，517 nm處測定吸光值，每組平行重復3次。對照組：取1 mL 90%乙醇加入5 mL 100 μmol/L DPPH溶液中，充分搖勻，室溫避光保存30 min后在517 nm處測定吸光值，平行重復3次。

DPPH自由基清除率（%）=[A0-A1A0]×100

式中，A0為1 mL 90%乙醇與5 mL 100 μmol/L DPPH溶液的混合液在517 nm處的吸光值，A1為1 mL標準品（樣品）溶液與5 mL 100 μmol/L DPPH溶液的混合液在517 nm處的吸光值。

以Trolox標準品濃度（mmol/L）為橫坐標、自由基清除率為縱坐標繪制標準曲線，把樣品溶液OD值代入標準曲線，計算其對應的標準品濃度，最終的總抗氧化能力以當量Trolox溶液濃度表示。

1. 2. 4 主要黃酮類物質(zhì)含量測定

1. 2. 4. 1 標準曲線繪制 嚴格稱取橙皮苷、川陳皮素和桔皮素標準品各20.00 mg，分別置于100 mL容量瓶中，加入甲醇超聲溶解并定容、搖勻。準確量取上述標準品溶液1、2、3、4和5 mL分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，即得到質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mg/mL的標準品溶液，經(jīng)HPLC分析。

色譜條件：Waters C18柱（4.6 mm×250 mm），流動相為甲醇∶水，280和330 nm雙波長檢測，進樣體積10 μL，柱溫40 ℃;梯度洗脫程序：0～10 min，40%～60%甲醇;10～15 min，60%～80%甲醇;15～20 min，80%～60%甲醇;20～25 min，60%～40%甲醇;25～30 min，40%甲醇;流速1.0 mL/min。

以標準品質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到表1的線性回歸方程。

1. 2. 4. 2 樣品溶液液相分析 稱取1 g黃酮提取物，加入50 mL 90%乙醇超聲溶解，得到提取液。分別取1 mL提取液過0.22 ?m微孔濾膜后進行液相分析，色譜條件同1.2.4.1，每個樣品重復3次。

1. 3 統(tǒng)計分析

使用SPSS 20.0和OriginPro 8.5對試驗數(shù)據(jù)進行整理分析并制圖。

2 結果與分析

2. 1 不同年份陳皮總黃酮含量的差異性分析

由圖1可知，2017、2013和2003年陳皮的總黃酮含量間存在顯著差異（P<0.05，下同），以2003年陳皮總黃酮含量最高，為6.66±0.12 mg RE/g;其次是2013年陳皮，其含量為6.05±0.01 mg RE/g;2017年陳皮總黃酮含量最低，為3.93±0.07 mg RE/g。2013年陳皮總黃酮含量較2017年陳皮增加53.94%，而2003年陳皮總黃酮含量較2013年陳皮增加僅10.08%，表明陳皮在貯藏期間，總黃酮含量在前5年增加速度較快，而在后10年增加幅度減小，也說明陳皮貯藏前5年是其總黃酮產(chǎn)生的關鍵時期，可能與陳皮表面微生物在陳皮貯藏早期進行頻繁代謝活動有關（劉素娟等，2017）。

2. 2 不同年份陳皮總黃酮的抗氧化活性分析

如圖2所示，在貯藏1年、5年到15年間，陳皮總黃酮的ABTS、FRAP和DPPH值均呈增長趨勢，且年份間差異顯著，說明陳皮貯藏越久其抗氧化活性越高;且3種方法中，ABTS值最大，其次是FRAP值，DPPH值最小。

ABTS與氫過氧化物和過氧化物酶形成ABTS+，而ABTS+與鐵—肌紅蛋白形成的混合物最大吸收波長在820、734和650 nm處，氫供體存在時，混合物在最大吸收波長處的OD值會下降;而抗氧化劑的抗氧化能力直接影響OD值的下降程度，因此OD值的下降程度能反映抗氧化能力（徐清萍等，2007）。由圖2可知，隨著陳皮貯藏時間延長，陳皮總黃酮的ABTS值顯著增加，2017、2013和2003年的ABTS值分別為4.85±0.08、9.56±0.04和18.50±0.26 mmol TE/g，2003年陳皮總黃酮的抗氧化能力較2017年陳皮增強2.81倍。

FRAP法原理為Fe3+-吡啶三吖嗪（TPTZ）在593 nm處有最大吸收峰，在抗氧化物質(zhì)作用下還原為Fe2+形式，呈藍色且吸光值增大。FRAP值越大說明抗氧化劑的還原能力越強（張方樂等，2009）。由圖2可知，陳皮總黃酮對鐵離子的還原能力隨貯藏時間延長呈顯著增長趨勢，2017、2013和2003年的FRAP值分別為0.92±0.03、2.81±0.03和12.46±0.42 mmol TE/g，說明2003年陳皮總黃酮的還原能力最強，分別是2013和2017年的4.43和13.54倍。

DPPH是有機溶劑中具有單一電子的一種穩(wěn)定自由基，最大吸收波長為517 nm。自由基清除劑會使DPPH的單電子被捕捉從而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光值也會下降，且呈線性相關，吸光值的降低表明抗氧化性增強，以此評價試驗樣品的抗氧化能力（楊秀梅等，2014）。由圖2可知，隨著陳皮貯藏時間的延長，不同年份陳皮總黃酮對DPPH自由基的清除能力顯著增強，其中，2003年陳皮總黃酮的清除能力最強，為2.45±0.01 mmol TE/g，是2013年陳皮（1.40±0.01 mmol TE/g）的1.75倍，是2017年陳皮（0.83±0.01 mmol TE/g）的2.95倍。以上結果表明，陳皮抗氧化能力與陳皮貯藏時間密切相關，且貯藏越久其抗氧化能力越強。

2. 3 HPLC分析不同年份陳皮中主要黃酮類物質(zhì)

按照1.2.4.1的HPLC分析條件，對橙皮苷、川陳皮素和桔皮素標準品及不同年份的陳皮樣品進行定性定量分析，將橙皮苷、川陳皮素和桔皮素標準品甲醇溶解后高效液相混標分析，結果如圖3所示。由圖3-A可知，橙皮苷、川陳皮素和桔皮素的保留時間分別為7.8、17.7和19.4 min，最大吸收波長分別為283、334和325 nm。在2017、2013和2003年貯藏的陳皮樣品中均能檢測出橙皮苷、川陳皮素和桔皮素，且為主要黃酮類物質(zhì);在陳皮貯藏1～5年過程中，橙皮苷檢測峰高變化不明顯，貯藏15年后，樣品中橙皮苷檢測峰高明顯增加;川陳皮素檢測峰高在陳皮貯藏1～5年中明顯降低，貯藏5～15年的陳皮，其檢測峰高降低不明顯;桔皮素在貯藏1～15年的陳皮中峰高變化呈穩(wěn)定降低趨勢（圖3-B）。

2. 4 不同年份陳皮中主要黃酮類物質(zhì)含量的差異性分析

如圖4所示，不同年份陳皮中橙皮苷、川陳皮素和桔皮素的含量均存在顯著差異，且隨著貯藏時間的延長，三者的含量均顯著增加。2017、2013和2003年陳皮中橙皮苷含量分別為1.39±0.06、2.26±0.34和5.02±0.07 mg/g，即2013年陳皮中橙皮苷含量是2017年陳皮的1.63倍，2003年陳皮中橙皮苷含量是2013年陳皮的2.22倍，2003年陳皮中橙皮苷含量較2017年陳皮增加2.61倍;2003年陳皮中川陳皮素含量為4.15±0.05 mg/g，較2013年（3.42±0.03 mg/g）增加21.35%，是2017年（2.55±0.06 mg/g）的1.63倍，表明在15年間陳皮中川陳皮素的含量變化相對于橙皮苷的變化幅度小;2017、2013和2003年陳皮中桔皮素含量分別為2.09±0.04、3.00±0.03和3.25±0.03 mg/g，2013年桔皮素含量較2017年增加43.54%，2003年較2013年增加8.33%，說明陳皮在貯藏期間，桔皮素含量的增加速度先快后慢。

對于貯藏1年和5年陳皮，其主要黃酮類物質(zhì)含量排序為川陳皮素>桔皮素>橙皮苷;而對于15年陳皮，其主要黃酮類物質(zhì)含量排序為橙皮苷>川陳皮素>桔皮素。

3 討論

現(xiàn)代藥理作用和臨床研究均表明，陳皮黃酮有抗氧化、抗腫瘤、抗炎和保護神經(jīng)等生理作用，在醫(yī)藥、保健食品、香精香料、日化品等領域具有很高的應用價植（李柯柯和任順成，2017;許珊珊等，2018），因此，從陳皮中提取黃酮類物質(zhì)已成為研究熱點。本研究以貯藏1年（2017年）、5年（2013年）和15年（2003年）的陳皮為對象，提取總黃酮，研究其變化規(guī)律及抗氧化活性，結果表明，不同年份陳皮的總黃酮含量不同，2017、2013和2003年陳皮的總黃酮含量分別為3.93±0.07、6.05±0.01和6.66±0.12 mg RE/g，隨著貯藏年限的增加，陳皮中總黃酮含量逐漸增加，其中陳皮在1～5年的陳化過程中，總黃酮含量顯著增加;在5～15年的陳化過程中，總黃酮含量增速變緩，與林林（2008）的研究結果一致。Wang等（2016）研究老化對陳皮的影響，提取來自代表性陳皮的游離和結合酚類化合物，結果表明，在老化期間，結合的酚類和類黃酮含量顯著升高，且其抗氧化活性增加，結合部分增強了老化陳皮的總效益，表現(xiàn)出更高的酚類和類黃酮含量，以及更強的抗氧化活性。由此可見，陳皮在陳化期間，其總黃酮含量隨著貯藏時間的延長而增加，可為陳皮“陳久者良”的說法提供科學理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，陳皮貯藏時間由1年（2017年）到5年（2013年）再到15年（2003年），總黃酮含量增加的同時，其對鐵離子的還原能力及對ABTS和DPPH自由基的清除能力均呈遞增趨勢，表明總黃酮含量的增加與其抗氧化活性有密切聯(lián)系，與Berreca等（2011）的研究結果一致。由于黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗菌等功效（Pernice et al.，2009），說明陳皮貯藏時間越長，抗氧化能力越強（Kim et al.，2013）。

陳皮中的黃酮類化合物主要包括橙皮苷、桔皮素和川陳皮素等，同樣具有抑菌、抗氧化和抗腫瘤等作用，不僅可用于降低膽固醇、預防動脈粥樣硬化等，還可作為保健因子添加到飼料和食品中（王慧芳等，2018）。本研究以3個貯藏年份的陳皮黃酮提取物為對象，分析橙皮苷、桔皮素和川陳皮素的含量變化規(guī)律，結果表明，陳皮陳化15年間，橙皮苷含量增加2.61倍，川陳皮素含量增加62.74%，桔皮素含量增加55.50%，3種主要黃酮類物質(zhì)含量的增加速度由大到小依次為橙皮苷>川陳皮素>桔皮素，與高蓓（2011）的研究結果一致。說明陳皮在陳化過程中，不同黃酮類物質(zhì)含量會隨陳皮貯藏時間的延長而發(fā)生變化，因其具有抗氧化、抗炎等多種生物活性，即陳皮的保健功效增強，為陳皮越陳越佳的說法提供了科學依據(jù)。

4 結論

隨著陳皮貯藏時間的延長，其總黃酮含量顯著增加，抗氧化能力增強，橙皮苷、川陳皮素和桔皮素3種主要的黃酮類物質(zhì)含量遞增。這一變化規(guī)律可為闡釋陳皮“陳久者良”的科學內(nèi)涵提供理論依據(jù)，對研究陳皮陳化品質(zhì)的形成及其調(diào)控具有參考價值。

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（責任編輯? 羅 麗）