杜少萱，吳 程，蘇月華，楊 梅

(福建師范大學生命科學學院，福州350100)

昆蟲是世界上種類最多的一個群體，數(shù)量眾多且分布廣泛(Mayhewetal.,2007)。由于昆蟲自身不存在獲得性免疫系統(tǒng)，所以先天性免疫作為昆蟲抵御病原微生物感染的重要防御系統(tǒng)顯得尤為重要(Kimbrelletal.,2001;Choeetal.,2005)。肽聚糖識別蛋白PGRPs是昆蟲模式識別受體中至關重要的一種病原識別蛋白，在昆蟲的先天免疫反應過程中發(fā)揮著重要的作用。

PGRPs在結(jié)構(gòu)上存在一個能與肽聚糖(peptidoglycan,PGN)結(jié)合的PGRP結(jié)構(gòu)域，約由165個氨基酸構(gòu)成，該結(jié)構(gòu)域在無脊椎動物到脊椎動物中都具有高度的保守性。PGRP結(jié)構(gòu)域與噬菌體T7的溶菌酶高度同源(Liepinshetal.,2003)，噬菌體T7溶菌酶具有裂解PGN的酰胺酶活性，因此有些病原微生物能夠被PGRPs直接殺死并清除(Werneretal.,2000;Liuetal.,2001;Dziarskietal.,2006)。根據(jù)肽聚糖識別蛋白分子量的大小，可以將已知昆蟲PGRPs蛋白分為2種形式，即長型(L型)跟短型(S型)，一般短型的PGRPs分子量大約在20～25 kDa，而長型的PGRPs分子量一般大于90 kDa(Guanetal.,2005;Dziarskietal.,2006)。研究表明大多數(shù)的S型 PGRPs主要在脂肪體內(nèi)合成，而大多數(shù)L型PGRPs在血細胞中有著較高的表達量(Dimopoulosetal.,2002)。根據(jù)PGRPs有無酰胺酶活性又可將PGRPs分為有酰胺酶活性的PGRPs和無酰胺酶活性的PGRPs兩種類型(Christophidesetal.,2002;Dziarskietal.,2003)。具有酰胺酶活性的PGRPs能斷開細菌肽聚糖中肽橋-酰胺鍵，使肽聚糖裂解，而失去免疫活性，導致IMD通路信號下調(diào)(Zaidmanrémyetal.,2011)。有些PGRPs因缺少酰胺酶活性中所必須的位點，而無酰胺酶活性，使其不能裂解肽聚糖，但是這種類型的PGRPs仍然可以在免疫反應中作為受體發(fā)揮作用，譬如在果蠅Drosophilamelanogaster中發(fā)現(xiàn)的PGRP-SA蛋白和PGRP-SD蛋白雖然沒有酰胺酶活性，卻可以使作為受體激活Toll信號通路(Zaidmanrémyetal.,2006;Leoneetal.,2008)。隨著基因組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展，目前已在鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目、直翅目、半翅目等多類昆蟲中鑒定到大量的PGRP基因(Mellrothetal.,2003;Guanetal.,2005;Dziarskietal.,2006;Hashimotoetal.,2007;Tanakaetal.,2008;Werneretal.,2008;Sumathipalaetal.,2010;Khajuriaetal.,2011;Kangetal.,2014;Jieetal.,2015)。

小菜蛾Plutellaxylostella屬于鱗翅目Lepidoptera菜蛾科Plutellidae，是一種主要危害白菜、蘿卜等十字花科植物的世界性遷飛害蟲，每年用于防控小菜蛾的費用高達40～50億美元(Furlongetal.,2013)。近年來基于免疫系統(tǒng)進行生物防治的概念逐漸被提出，因此研究小菜蛾的免疫防御反應對未來進行生物防控具有重要的意義。肽聚糖識別蛋白是一種高度保守的病原識別蛋白，在小菜蛾抵抗病原微生物的過程中發(fā)揮著重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了小菜蛾PGRP-S2基因，以原核表達的方式獲得了重組蛋白，并探究了重組蛋白與大腸桿菌E.coli和金黃色葡萄球菌S.aureus之間的相互作用，用來了解小菜蛾PGRP-S2在細菌侵染過程中的潛在功能，為后續(xù)進一步深入研究小菜蛾的天然免疫系統(tǒng)提供基礎。

1 材料與方法

1.1 小菜蛾

小菜蛾品系采集自福建省福州市閩侯縣南通鎮(zhèn)。

1.2 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliDH5α和BL21(DE3)以及金黃色葡萄球菌S.aureus由本實驗室保存；pMD19-T載體購自TaKaRa公司；pET28a載體由本實驗室保存。

1.3 供試試劑

Eastep? Super總RNA提取試劑盒、Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System DNA 膠回收試劑盒、DNA限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI購自Promega公司；ExTaq酶、250 bp DNA Marker、RACE反轉(zhuǎn)試劑盒SMARTer?RACE 5′/3′ Kit Components、T4 DNA 連接酶購自TaKaRa公司。

1.4 總RNA提取及cDNA合成

取成蟲形態(tài)的小菜蛾樣品5頭，按Eastep? Super總RNA提取試劑盒提取總RNA。紫外微量分光光度計及1.0 %凝膠電泳檢測RNA濃度及完整性。以提取的總RNA為模板，利用SMARTer? RACE 5′/3′ Kit Components試劑盒合成5′-cDNA與3′-cDNA，于-20℃保存。

1.5 5′-RACE與3′-RACE擴增

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中小菜蛾肽聚糖識別蛋白轉(zhuǎn)錄組序列(NCBI Reference Sequence：XM_011562450.1)的保守區(qū)域設計5′-RACE與3′-RACE特異性引物(表1)。以1.4節(jié)中反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用ExTaq酶進行第1輪擴增，反應體系為：10 ×ExTaqbuffer 1.5 μL，dNTP Mixture 0.5 μL，UPM 0.5 μL，引物10.5 μL，5′-RACE cDNA/3′-RACE cDNA 1.0 μL，ExTaq酶0.15 μL，ddH2O 10.9 μL。PCR擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。以第1輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍后作為第2 輪PCR反應的模板，UPS和引物2為擴增引物，進行第2輪擴增，擴增條件同上。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測正確后，回收純化，并送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序，測序結(jié)果用DNAStar進行拼接。

表1 PCR引物Table 1 Primers for PCR

1.6 小菜蛾 PGRP-S2基因生物信息學分析

利用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析PGRP-S2的開放閱讀框。利用CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html)預測PGRP-S2的保守結(jié)構(gòu)域；利用Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)預測PGRP-S2蛋白的理化性質(zhì)；利用Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)預測 PGRP-S2蛋白的親疏水性；利用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測 PGRP-S2蛋白是否存在信號肽；利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測 PGRP-S2蛋白是否存在跨膜結(jié)構(gòu)；利用ClustalX 2.0和MEGA 5.0 (Xie HYetal.,2017)進行序列比對分析和進化樹構(gòu)建(NJ法，1000次重復)。

1.7 小菜蛾 PGRP-S2基因的原核表達與純化

根據(jù)對序列的生物信息學分析結(jié)果，結(jié)合表達載體pET28a酶切位點信息，設計含有酶切位點的引物。在上游引物引入BamHI酶切位點，下游引物引入EcoRI酶切位點，引物見表1。PCR擴增獲得目的基因并連接到pMD19-T載體上，用BamHI酶和EcoRI酶對重組質(zhì)粒pMD19-T-PGRP-S2和pET28a質(zhì)粒進行雙酶切后用T4 DNA連接酶進行連接，以構(gòu)建重組表達載體pET28a-PGRP-S2。將重組表達載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，以空載的pET28a作為對照，接種單克隆菌株到含100 mg/mL kana的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、230 rpm過夜搖菌；次日按照1%的接種量接種于含100 mg/mL kana的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、230 rpm發(fā)酵至OD為0.6～0.9；向發(fā)酵液中加入1 mol/L的IPTG 30 μL，使IPTG的終濃度為0.6 mmol/L，18℃、150 rpm誘導24 h使目的蛋白表達，以未加IPTG誘導作為對照組。發(fā)酵結(jié)束后離心收集菌體進行超聲破碎，再次離心分別收集細胞破碎沉淀和上清液。12% SDS-PAGE分析蛋白表達結(jié)果。使用AKTA蛋白純化儀對目的蛋白進行Ni柱親和層析純化，利用HiTrapTMDesating脫鹽柱將蛋白純化緩沖液更換為Tris緩沖液以除去咪唑。

1.8小菜蛾 PGRP-S2蛋白功能驗證

取金黃色葡萄球菌(G+)與大腸桿菌BL21(DE3)(G-)劃線活化，挑取活化后的單菌落過夜培養(yǎng)，次日按1%的接種量加到30 mL LB液體培養(yǎng)基中發(fā)酵至 OD600為0.5，取1 mL發(fā)酵液離心收集沉淀，用Tris緩沖液洗滌3次，最后用1 mL Tris緩沖液懸浮菌體，備用。

1.8.1重組蛋白的凝集試驗

將供試菌懸液稀釋至原濃度的10-5倍，在1.5 mL離心管中建立如下反應體系：

表2 反應體系Table 2 The reaction system

加樣混勻，放置于搖床中37℃、150 rpm孵育3 h后，在倒置顯微鏡下觀察菌體的分布情況。

1.8.2重組蛋白的抑菌試驗

配制如表2所示的反應體系，對實驗組中的PGRP蛋白液設置濃度梯度(0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)，放置于搖床中37℃、150 rpm孵育3 h后，取70 μL反應液均勻涂布于LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，次日觀察菌落的生長情況，每組3次重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 小菜蛾5′-RACE與3′-RACE擴增

經(jīng)過兩輪的PCR擴增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5′端和3′端各出現(xiàn)一條特異性條帶，條帶大小與預期結(jié)果相同(圖1)。

圖1 RACE PCR 產(chǎn)物Fig.1 PCR product of RACE注:M，250 bp DNA 標準分子量；1，5′-RACE PCR產(chǎn)物；2，3′-RACE PCR產(chǎn)物。Note:M，250 bp DNA marker；1，PCR product of 5′-RACE；2，PCR product of 3′-RACE.

2.2 小菜蛾PGRP基因克隆及序列分析

對5′端和3′端的特異性條帶進行回收測序，并用SeqMan進行序列拼接。結(jié)果成功克隆了小菜蛾PGRP基因(圖2)，命名為PGRP-S2(GenBank:MG570190)，該序列的ORF全長為588 bp，編碼195個氨基酸。CDD結(jié)構(gòu)域預測顯示該序列含有典型的PGRP超家族保守結(jié)構(gòu)域跟酰胺酶結(jié)構(gòu)域(圖3)。Protparam分析結(jié)果表明其編碼的蛋白質(zhì)理論相對分子質(zhì)量為21.46 kDa，理論等電點pI為8.46。該蛋白不穩(wěn)定性參數(shù)為27.90，表明該蛋白屬于穩(wěn)定蛋白，平均親水性(GRAVY)為-0.075，預測該蛋白質(zhì)為水溶性蛋白質(zhì)。Protscale分析結(jié)果表明該蛋白屬于親水性蛋白質(zhì)，該結(jié)果與Protparam分析的結(jié)果一致。SignalP 4.1分析結(jié)果表明該蛋白N端存在一個由第1～21位氨基酸組成的信號肽。TMHMM預測該蛋白質(zhì)不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

2.3 小菜蛾 PGRP-S2基因系統(tǒng)進化分析

將PGRP-S2編碼的氨基酸序列與與已知功能的鱗翅目昆蟲如棉鈴蟲和柞蠶等的PGRP蛋白的氨基酸序列進行多重比對(圖4)，結(jié)果顯示，小菜蛾PxPGRP-S2中酰胺酶活性所必須的位點(52Q、161H、167T、169S，用*號表示)和大多數(shù)昆蟲具有高度同源性。系統(tǒng)進化分析顯示(圖5)，小菜蛾的PxPGRP-S2與家蠶的短(S)型肽聚糖識別蛋白BmPGRP-S1聚在同一分支上，兩者的進化距離最近。

圖2 PxPGRP-S2 基因序列及其編碼產(chǎn)物Fig.2 The gene sequence of the PxPGRP-S2 and its deduced amino acid 注：單下劃線表示信號肽序列；雙下劃線表示PGRP結(jié)構(gòu)域。Note:The underlined signal indicates the signal peptide sequence;the double underline indicates the the PGRP domain.

圖3 克隆序列編碼產(chǎn)物 PGRP-S2 的保守區(qū)域分析Fig.3 Analysis of conserved domains of the product PGRP-S2 encoded by the cloned sequence

圖4 小菜蛾 PxPGRP-S2 氨基酸序列和其他昆蟲PGRPs氨基酸序列比對Fig.4 Amino acid sequence alignment of PGRP-S2 from Plutella xylostlla with PGRPs from other insects注：*表示小菜蛾 PGRP-S2酰胺酶活性位點，PGRPs來源及GenBanak登錄號如下：PxPGRPs,小菜蛾；ApPGRPs,柞蠶；BmPGRPs,家蠶；DmPGRPs,果蠅；HaPGRPs,棉鈴蟲；MsPGRPs,煙草天蛾；SlPGRPs,斜紋夜蛾。Note：* indicates the PxPGRP-S2 amidase active site of P.xylostella.The origin of PGRPs and their GenBank accession numbers were as follows:PxPGRPs,Plutella xylostella (PxPGRP-S2:MG570190);ApPGRPs,Antherea pernyi (ApPGRP-A:AME17978.1;ApPGRP-B:AME17979.1;ApPGRP-C:AME17980.2);BmPGRPs,Bombyx mori (BmPGRP-S1:NM_001043371.1;BmPGRP-S2:KF906541.1;BmPGRP-S5:NM_001043393.1);DmPGRPs,Drosophila melanogaster (DmPGRP-SC2:NP_610410.1);HaPGRPs,Helicoverpa armigera (HaPGRP-A:KF954940.1;HaPGRP-C:JX082167.1;HaPGRP-D:KF985962.1);MsPGRPs,Manduca sexta (MsPGRP-1A:AF413068.1;MsPGRP-1B:AF413061.1;MsPGRP-2:GQ293365.1);SlPGRPs,Spodopter litura (SlPGRP:XP_022825445.1)

圖5 小菜蛾 PxPGRP-S2與其它昆蟲肽聚糖識別蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of PxPGRP-S2 of Plutella xylostella and PGRPs from other different insect species注：PGRPs來源：同圖3。Note:Origin species of PGRPs:The same to Fig.3.

2.4 小菜蛾PxPGRP-S2原核表達及純化

重組工程菌BL21(DE3)-pET28a-PGRP-S2，經(jīng)IPTG誘導后，高效表達可溶性蛋白(圖6)，誘導的上清液(圖6第2泳道)相對于對照組(圖6第1泳道)在約25 kDa處附近出現(xiàn)一條特異性條帶，與預期的大小一致。使用AKTA蛋白純化系統(tǒng)對目的蛋白進行Ni柱親和層析純化，洗脫得到目的蛋白(圖6第6-9泳道)。

圖6 SDS-PAGE 檢測純化的 PxPGRP-S2 蛋白Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified PGRP-S2 protein purification注：M，蛋白質(zhì)分子量標準品；1，未誘導對照組；2，破壁上清液；3，穿透液；4-9，20～500 mM咪唑濃度線性梯度洗脫蛋白。Note:M，Protein Marker；1，No induction control；2，Broken supernatant；3，Penetration；4-9，The protein was eluted with a gradient of 20～500 mM imidazole.

2.5 小菜蛾PxPGRP-S2蛋白功能驗證

2.5.1重組蛋白的凝集試驗

重組蛋白PxPGRP-S2和兩種細菌的凝集試驗結(jié)果如圖7所示，在孵育3 h后，大腸桿菌對照組(圖7 A)和金黃色葡萄球菌對照組(圖7 C)中的菌體均以游離狀態(tài)分布，未發(fā)生凝集現(xiàn)象；經(jīng)過重組蛋白PxPGRP-S2處理后的大腸桿菌(圖7 B)和金黃色葡萄球菌(圖7 D)與對照組相比發(fā)生了凝集(圖7 B，圖7 D中箭頭標注的位置)，提示PxPGRP-S2蛋白對細菌具有凝集作用。

2.5.2重組蛋白的抑菌試驗

利用重組蛋白PxPGRP-S2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行抑菌效應分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組單菌落均勻分布在培養(yǎng)基上面，沒有連成塊狀，而實驗組因加入重組蛋白PxPGRP-S2后，菌體之間相互凝集在一起，在培養(yǎng)基上形成團狀，且隨著重組蛋白濃度的增加，形成的團狀越大，表明隨著重組蛋白濃度的增加，更多的菌體凝集在一起。但從對照組和實驗組的菌落數(shù)量上觀察，重組蛋白PxPGRP-S2并沒有起到抑菌效果，不具有統(tǒng)計學意義。表明PxPGRP-S2蛋白對于這2種菌只有凝集作用而無殺菌功能。

3 結(jié)論與討論

在果蠅PGRPs的研究中，目前從果蠅基因組中鑒定出來的13個肽聚糖識別蛋白，其中有7個L型的肽聚糖識別蛋白含有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽，它們被確認為跨膜蛋白(如PGRP-LC)；而多數(shù)S型的肽聚糖識別蛋白，在它們的氨基酸序列中只有信號肽而不存在跨膜域，它們可能作為分泌蛋白(Lemaitreetal.,2007)。對小菜蛾PGRP-S2序列進行信號肽以及跨膜分析表明該序列編碼的蛋白存在信號肽結(jié)構(gòu)但不存在跨膜結(jié)構(gòu)，推測該序列編碼的蛋白屬于分泌型蛋白的可能性較大。

圖7 重組蛋白PxPGRP-S2對兩種細菌的凝集反應Fig.7 The agglutination of PxPGRP-S2 reconbinant protein with two types of bacteriaA，Escherichia coli/Tris(ZnCl2)；B，E.coli/PxPGRP-S2(ZnCl2)；C，S.aureus/Tris(ZnCl2)；D，S.aureus/PxPGRP-S2(ZnCl2)

基于前期對PGRPs功能的研究發(fā)現(xiàn)不管是無脊椎動物還是脊椎動物，能夠使細菌肽聚糖裂解的PGRP蛋白很可能具有抗菌活性，比如在果蠅中的PGRP-SB1蛋白(Geliusetal.,2003)，以及人類、小鼠還有文昌魚中的PGRP-L蛋白(Wangetal.,2003;Yangetal.,2010;Fengetal.,2012;Lietal.,2012)，這些蛋白在免疫過程中直接作為殺菌因子。果蠅PGRP-SB1蛋白因其具有保守的酰胺酶結(jié)構(gòu)而具有抗菌活性，但并不是所有具有酰胺酶活性結(jié)構(gòu)域的PGRP蛋白都具有殺菌活性，比如果蠅PGRP-SC蛋白也具有保守的酰胺酶結(jié)構(gòu)，但該蛋白就沒有直接的抗菌活性(Mellrothetal.,2006)，同時羅嫚等人(2016)對家蠅PGRP-SA蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白能夠與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌結(jié)合，但是并不能直接殺死它們，而是通過與它們結(jié)合并識別，從而激活Toll信號通路，引起下游抗菌肽的表達。

本研究發(fā)現(xiàn)小菜蛾PxPGRP-S2蛋白能夠介導大腸桿菌和金黃色葡萄球菌發(fā)生凝集反應，但并不具備直接的抗菌活性，表明該蛋白雖然具有酰胺酶結(jié)構(gòu)域，但不具備酰胺酶活性，其作用機理可能是通過識別并結(jié)合細菌表面的肽聚糖，激活下游信號通路產(chǎn)生抗菌肽等殺菌物質(zhì)，實現(xiàn)對病原微生物的免疫防御。當然，對于該蛋白具體功能和作用機制的研究還有很長的路要走，比如該蛋白在小菜蛾體內(nèi)的功能是什么？主要響應的是哪一類病原微生物？其介導的下游免疫信號通路是哪些？具體的機制如何？這些問題均需要在后續(xù)的研究中進一步深入探討。本研究為深入研究該蛋白的體內(nèi)功能提供了必不可少的序列信息、重組蛋白以及初步的功能預測。