梅昭利，曹成全，童 超，劉方慶，徐丹陽

(樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川樂山 614004)

作為一類著名的景觀昆蟲，螢火蟲在旅游和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，其人工繁育研究和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用也逐步成為行業(yè)熱點(diǎn)(曹成全，2016，2019；陳政頤，2016；葉超，2016)。

三葉蟲螢EmeiapseudosauteriFu(Ballantyne &Lambkin,2012)隸屬于螢科Lampyridae峨眉螢屬Emeia，是發(fā)現(xiàn)于四川省樂山市峨眉山的新種，在四川省廣泛分布于樂山、峨眉、邛崍等地(Fuetal.,2012)。三葉蟲螢的基礎(chǔ)研究主要集中在該幼蟲和成蟲的形態(tài)特征、行為習(xí)性、生殖生理、棲境分析和夜間活動(dòng)規(guī)律等方面(Fuetal.,2012;陳申芝等，2014；季現(xiàn)瑩，2014；盧聰聰?shù)龋?017；陳申芝等，2018；童超等，2018；陳鄭偉等，2019)。

由于成蟲起飛時(shí)間早、養(yǎng)殖較為容易等優(yōu)點(diǎn)(陳申芝等，2014；盧聰聰?shù)龋?017)，三葉蟲螢?zāi)壳俺蔀槿斯し庇膬?yōu)選種類。盧聰聰?shù)?2017)研究了不同環(huán)境和介質(zhì)對(duì)三葉蟲螢卵孵化的影響。本文研究了不同溫度對(duì)三葉蟲螢卵孵化和初孵幼蟲發(fā)育的影響，以期在豐富三葉蟲螢生物學(xué)資料的同時(shí)，為其人工繁育和產(chǎn)業(yè)化提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲源及試驗(yàn)材料

1.1.1成蟲選取

根據(jù)相關(guān)報(bào)道(陳申芝等，2014；童超等，2018)，成蟲選取地點(diǎn)位于四川省樂山市綠心公園(103°42′42.00″～103°45′10.57″E,29°33′44.37″～29°35′40.11″N)內(nèi)的停耕農(nóng)田，采集時(shí)間為3月中旬至4月中旬。

1.1.2成蟲處理

成蟲室內(nèi)產(chǎn)卵環(huán)境模擬野外產(chǎn)卵介質(zhì)，由下到上分別為濕潤(rùn)土層、苔蘚層、蕨類植物層，然后噴水至苔蘚濕潤(rùn)后放入成蟲，等待其交配產(chǎn)卵。當(dāng)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵，用鏟子連帶土和苔蘚一起取其卵塊，放入培養(yǎng)皿中分組處理。

1.1.3飼料

成蟲人工飼養(yǎng)時(shí)可用直徑約為0.5 cm的棉球蘸取5%蜂蜜水放入環(huán)境中代替野外露水，以確保其能正常生存和交配產(chǎn)卵。

1.1.4器材

經(jīng)高壓滅菌處理的培養(yǎng)皿，恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：鄭州生元儀器有限公司MGC-250H)，衛(wèi)生紙，硫酸紙，滴管等。

1.2 方法

1.2.1孵化環(huán)境

以當(dāng)天采集的土和苔蘚為孵化介質(zhì)，加入少量濕潤(rùn)衛(wèi)生紙巾以保濕遮陰，濕度以其野外生存環(huán)境濕度為宜(介質(zhì)濕度為40%，紙巾濕度約為50%)。將取回的卵隨機(jī)分配，每個(gè)培養(yǎng)皿中放入30粒。將濕潤(rùn)的衛(wèi)生紙鋪在卵粒上方，盡量減少對(duì)卵粒的移動(dòng)和破壞。上述設(shè)置完成之后，將培養(yǎng)皿隨機(jī)分組，每組3個(gè)培養(yǎng)皿，分別標(biāo)號(hào)為1、2、3，將分組后的培養(yǎng)皿分別放置到5個(gè)恒定溫度下和室內(nèi)常溫條件下，其中12℃、15℃、20℃、25℃、30℃通過恒溫箱控制，控溫誤差在±1℃。在試驗(yàn)期間，光照為12L ∶12D，空氣濕度約為90%。常溫組為室內(nèi)自然通風(fēng)條件且減少外界條件(如天敵傷害、自然強(qiáng)光、惡劣天氣、人為踐踏、重物沖擊、洪水等)對(duì)卵粒傷害以作為對(duì)照組，該組溫度隨自然溫度變化而變化，不作特殊處理；晝夜變化范圍16～28℃。

1.2.2孵化處理

每天定時(shí)檢查卵粒情況，并且對(duì)其噴水保濕。每次澆水量約為每個(gè)培養(yǎng)皿2 mL。觀察記錄卵粒發(fā)霉破碎、孵化等情況。

當(dāng)出現(xiàn)卵粒孵化時(shí)，每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)不同溫度下卵粒的孵化情況。待卵粒孵化完成后，統(tǒng)計(jì)其孵化率，以及20 d以內(nèi)(20 d內(nèi)三葉蟲螢幼蟲狀態(tài)不穩(wěn)定，容易死亡)的存活率。

1.2.3幼蟲養(yǎng)殖

將同一天孵化出的幼蟲放在孵化溫度下進(jìn)行養(yǎng)殖，且同一溫度下同一天孵化的幼蟲設(shè)為1組，并標(biāo)明孵化日期和數(shù)量。將幼蟲直接放置在處理過的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中放置1張折疊為0.5 mm的濕潤(rùn)衛(wèi)生紙，其濕度為50%。在投餌時(shí)根據(jù)其濕度情況適當(dāng)澆水，以保持濕度，并且對(duì)其環(huán)境及時(shí)清理，1～3 d更換1次紙巾。

初孵幼蟲用處理好后剁碎的灰巴蝸牛Bradybaenaravida肉進(jìn)行喂養(yǎng)(陳申芝等，2014；童超等，2018)，剁碎食物以每頭幼蟲提供0.1 g的量盛放在大小適宜的硫酸紙上，避免食物直接放置在其環(huán)境中，污染生存環(huán)境，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。幼蟲飼養(yǎng)每天投餌1次，投餌時(shí)間模擬野生三葉蟲螢進(jìn)食時(shí)間，約為每天的17 ∶00-20 ∶00。

1.2.4數(shù)據(jù)記錄

觀察并記錄不同溫度下的孵化率和20 d內(nèi)初孵化幼蟲的存活率。

1.3 計(jì)算方法

1.3.1直線回歸法(張孝羲，2002；郭昆等，2018)

用直線回歸法推算三葉蟲螢卵的發(fā)育起點(diǎn)溫度(℃)和有效積溫(K)，所有公式如下：

1.3.2直接最優(yōu)法(David W，1986)

運(yùn)用直接最優(yōu)法計(jì)算三葉蟲螢卵的發(fā)育起點(diǎn)溫度(℃)和有效積溫(K)。該方法的基本原理是利用極值法，將理論有效積溫與實(shí)際測(cè)得的有效積溫誤差縮減到最小的目標(biāo)上。理論算得的有效積溫和試驗(yàn)測(cè)得的有效積溫的誤差極小為目標(biāo)的目標(biāo)函數(shù)，再用極值理論方法直接計(jì)算發(fā)育起點(diǎn)溫度(℃)，涉及公式為：

式中的Di為第i組處理溫度(Ti)下的發(fā)育歷期，T為溫度(℃)，i為處理數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)三葉蟲螢卵孵化的影響

室內(nèi)變溫條件下(通風(fēng)室內(nèi)環(huán)境，溫度在16～28℃變化)每組卵的孵化率都高于96.00%，且個(gè)別組的孵化率為100%，平均孵化率達(dá)98.00%±1.57%，高于其他組別孵化率(P<0.001)。恒溫下12～25℃三葉蟲螢卵的孵化率隨著溫度的升高而降低；恒溫12℃下的孵化率是上述溫度中孵化率最高的1個(gè)，平均孵化率為94.44%±4.16%(n=3)；在恒溫15℃時(shí)的平均孵化率較高為92.22%±5.67%，個(gè)別組的孵化率達(dá)到100%；恒溫20℃下的平均孵化率為76.67%±7.20%，且在此溫度下孵化率的最大值為83.33%，最小值為66.67%；恒溫25℃下的孵化率普遍較低，平均孵化率只有44.44%±11.00%；恒溫30℃時(shí)，卵孵化率最低，平均孵化率僅有13.33%±1.62%(圖1)。

圖1 不同溫度下三葉蟲螢卵的平均孵化率Fig.1 Average hatching rates of Emeia pseudosauteri eggs under different temperatures注：不同小寫字母表示不同溫度下孵化率差異顯著。Note:Different lowercase letters indicate significant differences in hatching rates at different temperatures.

2.2 溫度對(duì)三葉蟲螢初孵幼蟲存活率的影響

溫度對(duì)三葉蟲螢初孵幼蟲的成活率影響顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。不同溫度下，相同時(shí)間內(nèi)孵化的幼蟲存活率差別很大：在開始孵化后的20 d內(nèi)，溫度條件為15～30℃的初孵幼蟲存活率隨著溫度的升高而降低；恒溫12℃和30℃下初孵幼蟲難以生存，存活率為0%；25℃下初孵幼蟲的存活率僅為21.95%；20℃下初孵幼蟲的成活率為53.62%；15℃下初孵幼蟲的成活率73.17%(圖2)。

圖2 不同溫度下三葉蟲螢幼蟲存活率Fig.2 Survival rates of Emeia pseudosauteri larvae under different temperatures注：不同小寫字母表示不同溫度下存活率差異顯著。Note:Different lowercase letters indicate significant differences in survival rates at different temperatures.

2.3 溫度對(duì)三葉蟲螢卵發(fā)育歷期的影響

溫度對(duì)三葉蟲螢卵的發(fā)育歷期有顯著的影響。隨著溫度的升高，卵的發(fā)育歷期逐漸變短。在12℃下，卵的發(fā)育歷期達(dá)到42.96±1.49 d；在15℃下，卵的發(fā)育歷期達(dá)到33.47±1.87 d；在20℃下，卵的發(fā)育歷期達(dá)到24.05±0.32 d；在25℃下，卵的發(fā)育歷期為19.92±0.65 d；當(dāng)溫度在30℃時(shí)，由于溫度過高，卵大部分發(fā)霉或損壞，少數(shù)能孵化，發(fā)育歷期為12.75±0.25 d(P<0.001)；常溫(16～28℃)條件下，卵的發(fā)育歷期為20.63±1.82 d，較恒溫25℃時(shí)的數(shù)值相差不大(圖3)。

圖3 不同溫度下三葉蟲螢卵的發(fā)育歷期Fig.3 Developmental duration of Emeia pseudosauteri eggs under different temperatures

2.4 三葉蟲螢卵的發(fā)育起點(diǎn)溫度和有效積溫

本研究根據(jù)運(yùn)用直線回歸法和直接最優(yōu)法推算出三葉蟲螢卵的發(fā)育起點(diǎn)溫度為5.71℃和3.52℃，算出了三葉蟲螢卵的有效積溫分別為328.78 d·℃和382.20 d·℃。兩種方法得出的發(fā)育起點(diǎn)溫度相差2.19℃，有效積溫相差了53.42 d·℃；直接最優(yōu)法的變異系數(shù)c.v.(15.70%)，小于直線回歸法的變異系數(shù)(25.52%)，見表1。因此，對(duì)于三葉蟲螢卵的發(fā)育起點(diǎn)溫度和有效積溫，直接最優(yōu)法的計(jì)算結(jié)果較直線回歸法更優(yōu)。

表1 三葉蟲螢卵的發(fā)育起點(diǎn)溫度和有效積溫Table 1 The development zero and effective accumulated temperature of Emeia pseudosauteri eggs

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，溫度是影響三葉蟲螢卵孵化和生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵因素：溫度在室內(nèi)常溫(16～28℃之間變化)情況下的孵化率最高，但其20 d內(nèi)的存活率較低，且室內(nèi)變溫條件不可控。在恒溫12～30℃范圍內(nèi)，三葉蟲螢卵均能孵化，其孵化率隨溫度升高而降低，發(fā)育歷期也隨溫度升高而降低，發(fā)育速率隨溫度升高加快，且在高溫環(huán)境下，其孵化率不穩(wěn)定。溫度對(duì)三葉蟲螢卵的孵化率的影響與溫度對(duì)小金蝠蛾卵孵化情況相似(涂永勤等，2011)，最適孵化溫度也相近，為恒溫15℃左右。

溫度對(duì)三葉蟲螢初孵幼蟲的存活率影響顯著。在15～25℃，初孵幼蟲的成活率隨著溫度的升高而降低。當(dāng)溫度達(dá)到恒溫30℃時(shí)，初孵幼蟲無法長(zhǎng)期生存，所有幼蟲在24～48 h內(nèi)全部死亡。初孵幼蟲在恒溫15℃時(shí)存活率相對(duì)較高，20 d內(nèi)的存活率達(dá)到73.17%；20℃下初孵幼蟲20 d內(nèi)的存活率為53.62%，其它恒溫溫度和常溫條件下的存活率都較低；恒溫12℃時(shí)，由于溫度太低，初孵幼蟲無法長(zhǎng)期在此溫度下生存，20 d內(nèi)的存活率為0%。因此，溫度對(duì)三葉蟲螢初孵幼蟲的適溫范圍比較狹窄。

本研究中用直接最優(yōu)法得到的三葉蟲螢卵的發(fā)育起點(diǎn)溫度為3.52℃，有效積溫為382.20 d·℃，回歸直線方程為T=3.52+382.20V，計(jì)算結(jié)果優(yōu)于直線回歸法。

綜上所述，溫度顯著影響三葉蟲螢卵孵化、存活率和發(fā)育歷期。因此，人工繁育孵化時(shí)需考慮好溫度等條件。建議人工孵化溫度在恒溫15～20℃狀態(tài)下，初孵幼蟲養(yǎng)殖盡量避免超過30℃的高溫和低于12℃的低溫。