楊 森，慕永平，張 玨

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院1.檢驗(yàn)科； 2.肝病研究所，上海 201203

原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是特異性的自身免疫性疾病，其病變?yōu)樾∪~間膽管上皮細(xì)胞發(fā)生變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)引起的肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性破壞伴門脈炎癥性改變，導(dǎo)致膽汁淤積，肝損傷后，星狀細(xì)胞活化，肝細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)增生，瘢痕組織(scar tissue)取代正常肝細(xì)胞，進(jìn)而肝臟發(fā)生纖維化，肝纖維化晚期即為肝硬化，甚至肝癌[1]。

Notch基因是在果蠅體內(nèi)由Morgan于1916年發(fā)現(xiàn)，其與細(xì)胞增殖、活化、凋亡和組織形成密切相關(guān)[2]。Notch基因是哺乳動(dòng)物體內(nèi)一段高度保守調(diào)控細(xì)胞的基因[3]。研究發(fā)現(xiàn),Notch信號(hào)通路的異?；罨c肝癌、肺癌等惡性腫瘤密切相關(guān)[4-5]。Notch信號(hào)通路通過(guò)激活NF-κB、Wnt和TGF-β的方式促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和抑制其凋亡[6]。本文探討PBC患者外周血中巨噬細(xì)胞膜Notch受體表達(dá)情況及其與巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑抗凝管；15 ml離心管；1.5 ml EP管；流式管；恒溫水浴箱；高速離心機(jī)；醫(yī)用冰箱；酶標(biāo)儀；移液槍；流式細(xì)胞儀。紅細(xì)胞裂解液；PBS緩沖液；人Notch1-PE流式抗體(Biolegend公司)、人Notch2-FITC流式抗體(Biolegend公司)、人Notch3-PE流式抗體(Biolegend公司)；人CD68-FITC流式抗體(BBI公司)；人CCR2-PE流式抗體(BBI公司)；人CD163-PE流式抗體(BBI公司)；人CX3CR1-FITC流式抗體(BBI公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本：本研究所需外周血采集自我院收治的PBC確診患者30例，男12例，女18例，年齡(39.46±5.76)歲，分為早期PBC組和晚期PBC組，每組15例?；颊咴\斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)美國(guó)肝臟協(xié)會(huì)(AASLD)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床體征表現(xiàn)為膽汁淤積；(2)抗線粒體抗體(AMA)陽(yáng)性；(3)腹部影像學(xué)檢查無(wú)其他膽道疾病，病理學(xué)上表現(xiàn)為小葉間膽管損傷和非化膿性膽管炎。另采集我院體檢中心健康體檢者外周血15名作為對(duì)照組，男6名，女9名，年齡(40.12±5.61)歲。入選的健康體檢者與PBC組患者在年齡、性別等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)同意，且患者簽訂知情同意書。

1.2.2 血清收集：采集PBC組和健康對(duì)照組清晨空腹靜脈血2 ml于EDTA抗凝管中，然后立即對(duì)采集的外周靜脈血行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者巨噬細(xì)胞膜表面Notch受體表達(dá)情況及巨噬細(xì)胞分型情況。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：以CD68/CCR2雙陽(yáng)性代表M1型巨噬細(xì)胞，以CD163/CX3CR1雙陽(yáng)性代表M2型巨噬細(xì)胞，M2/M1比值表示巨噬細(xì)胞極化情況。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞膜上的Notch受體，具體如下：

將抗凝管中的血樣本用移液槍分別移至10個(gè)標(biāo)記的流式管中(對(duì)照管、CD68、CCR2、CD163、CX3CR1、Notch 1～3各1個(gè);CD68/CCR2、CD163/CX3CR1各2個(gè))，每管各100 ml；然后在管Notch 1～3中分別加入5 μl的Notch1-PE、Notch2-FITC、Notch3-PE流式抗體，在管CD68、CD68/CCR2管中加入5 μl的CD68-FITC流式抗體，在CCR2、CD68/CCR2管中加入5 μl的CCR2-PE流式抗體，在CD163、CD163/CX3CR1管加入5 μl的CD163-PE流式抗體，在CX3CR1、CD163/CX3CR1管中加入5 μl的CX3CR1-FITC流式抗體。對(duì)照管中加入5 μl的PBS液。震蕩混勻，置于室溫避光下孵育45 min；然后每管注入200 μl的紅細(xì)胞裂解液，震蕩30 s后，離心10 min，3 000 r/min。棄上清，加入500 μl PBS液充分懸浮沉淀，再離心10 min，3 000 r/min，重復(fù)3次；然后每管加入100 μl PBS液，充分混勻，過(guò)濾后，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0和GraphPad 6.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，經(jīng)相關(guān)性分析Notch受體表達(dá)與M1/M2型巨噬細(xì)胞比例的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞膜Notch受體表達(dá)情況早期PBC患者巨噬細(xì)胞膜表面Notch1受體表達(dá)水平較健康對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而早期PBC患者巨噬細(xì)胞膜表面Notch2受體和Notch3受體表達(dá)水平與健康對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。晚期PBC患者巨噬細(xì)胞膜表面Notch1受體和Notch3受體表達(dá)升高，與健康對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而Notch2受體表達(dá)與健康對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。晚期PBC患者Notch1受體和Notch3受體表達(dá)水平較早期PBC患者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖1)。

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05;與早期PBC組比較，△P<0.05。

2.2 巨噬細(xì)胞M2/M1比值與Notch受體表達(dá)水平的相關(guān)性分析以M2/M1比值表示巨噬細(xì)胞極化的程度。將流式細(xì)胞法檢測(cè)的M2/M1比值與巨噬細(xì)胞膜表面的Notch受體作線性相關(guān)分析(見(jiàn)圖2)。結(jié)果顯示，Notch1受體與M2/M1比值呈直線線性相關(guān)，Notch2和Notch3與M2/M1比值無(wú)直線線性相關(guān)。

圖2 PBC患者外周血清M2/M1與膜Notch1～3線性關(guān)系 A: M2/M1與膜Notch1的關(guān)系； B：M2/M1與膜Notch2的關(guān)系；C：M2/M1與膜Notch3的關(guān)系Fig 2 Linear relationship between peripheral serum M2/M1 and membrane Notch1-3 in patients with PBC A: relationship between M2/M1 and membrane Notch1; B: relationship between M2/M1 and membrane Notch2; C: relationship between M2/M1 and membrane Notch3

3 討論

PBC是自身免疫性肝臟疾病，是由于肝臟淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肝膽管上皮細(xì)胞損傷膽管漸進(jìn)性破壞及高滴度AMA出現(xiàn)，導(dǎo)致膽道狹窄，甚至堵塞，膽汁淤積于肝膽管中。該病多發(fā)于女性[7]。PBC發(fā)展到失代償期，肝臟無(wú)法自身修復(fù)，病情不可逆，逐漸發(fā)展為肝衰竭，增加了臨床病亡率[8-9]。

Notch受體為Ⅰ型單次跨膜蛋白，包括胞內(nèi)兩個(gè)亞基和胞外一個(gè)亞基，分子力量30 000，Notch受體家族有4種受體即Notch1～4[10-11]。在哺乳動(dòng)物中，Notch信號(hào)通路有5種配體，稱為DSL(Delta-1 配體、Delta-3配體、Delta-4配體及Jagged1配體、Jagged2配體)[12]。胞外亞基中的表皮因子重復(fù)序列(EGFR)是Notch受體和配體間的橋梁，在受體配體結(jié)合中起重要作用[13-14]。調(diào)控蛋白的脯氨酸/谷氨酸/絲氨酸/蘇氨酸(PEST)、錨蛋白和轉(zhuǎn)錄跨膜區(qū)構(gòu)成了胞內(nèi)亞基[15]。研究發(fā)現(xiàn),Notch信號(hào)通路無(wú)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，這是由于Notch信號(hào)通路激活的過(guò)程中無(wú)第二信使的參與[3]。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞的活化與Notch信號(hào)通路有關(guān)[16]，促炎性巨噬細(xì)胞(LSP)和巨噬細(xì)胞(LSP+IFN-γ)中Notch1～3受體可被檢測(cè)表達(dá)[17]。在小腸中，CD11c+CX3CR1+巨噬細(xì)胞亞群分化必須依靠Notch1和Notch2受體[18]。并且Notch配體在促炎性巨噬細(xì)胞中也可被檢測(cè)。Jagged1配體在促炎性巨噬細(xì)胞中能顯著放大[19]。在敲除Notch基因病癥中，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞無(wú)法聚集，肝膽道細(xì)胞無(wú)反應(yīng)進(jìn)而影響肝膽道的自我修復(fù)能力，臨床上稱Alagille綜合征，表現(xiàn)為膽汁淤積和膽管發(fā)育不良[20]。膽管發(fā)育中的膽管板重塑和小管形成必須依靠Notch信號(hào)通路的活化[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，早期PBC患者巨噬細(xì)胞膜表面Notch1受體表達(dá)異常，較健康者表達(dá)升高，而Notch2受體和Notch3受體表達(dá)水平無(wú)明顯變化。晚期PBC患者巨噬細(xì)胞膜表面Notch1受體和Notch3受體較健康者表達(dá)升高，而Notch2受體表達(dá)無(wú)明顯改變。晚期PBC患者Notch1受體和Notch3受體表達(dá)水平較早期高。巨噬細(xì)胞極化M2/M1比值與Notch受體表達(dá)水平呈直線線性相關(guān)，即隨著Notch受體表達(dá)水平的升高，巨噬細(xì)胞極化M2/M1比值升高。綜上，表明PBC患者外周血巨噬細(xì)胞中Notch受體表達(dá)異常，且巨噬細(xì)胞極化與Notch受體表達(dá)水平呈直線相關(guān)。