李 明，譚詩云，柴 紅

武漢大學人民醫(yī)院消化內(nèi)科 消化系湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430060

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，其死亡率很高。特別是在發(fā)展中國家，胃癌患者的數(shù)量占全球胃癌患者的70%以上[1]。幽門螺桿菌感染、不良生活習慣(如吸煙、飲酒和高鈉攝入量)和遺傳因素是導致胃癌的主要原因。目前，改善胃癌患者預后的治療手段有限。在早期胃癌中由于缺乏診斷標志物,大多數(shù)患者在診斷時已處于晚期階段。并且，由于復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)的治療手段經(jīng)常治療效果不佳[2]。隨著生物學的迅速發(fā)展，闡明胃癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制是實現(xiàn)胃癌靶向治療的關鍵。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)為長度超過200個核苷酸，但不具有蛋白編碼能力的RNA分子。雖然lncRNA不具有編碼蛋白的能力，但它可在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平等層面調(diào)控基因的表達[3]。lncRNA在各種生物過程中起重要作用，如細胞生長、分化、死亡，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4-10]。LOXL1-AS1是一種lncRNA，編碼在賴氨酰氧化酶樣1(LOXL1)基因的相反鏈上[11]。它在細胞應激反應中起重要作用，并與剝脫綜合征的發(fā)展相關[12]。有研究報道，LOXL1-AS1在膠質(zhì)母細胞瘤的間充質(zhì)亞型(MES)中高表達，并通過NF-κB途徑促進MES特征的表達[13]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，LOXL1-AS1通過激活PI3K/AKT途徑調(diào)節(jié)成神經(jīng)管細胞瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[14]。然而，LOXL1-AS1在胃癌中的作用尚不明確，本研究旨在觀察LOXL1-AS1在胃癌中的表達，探討其與胃癌生物學行為和臨床病理特征的關系，以期為闡明胃癌發(fā)生、發(fā)展機制及胃癌治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 樣本收集收集2018年1月至2019年1月在武漢大學人民醫(yī)院行手術治療的89例胃癌患者資料，取其癌組織樣本及距癌組織2 cm的癌旁正常組織，術后均經(jīng)病理檢查明確診斷。男49例，女40例，年齡26～70歲。所有患者術前均未行放化療，未服用過靶向治療藥物，并簽署知情同意書。將收集的癌組織和癌旁正常組織凍于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 qRT-PCR檢測胃癌組織及癌旁組織標本中LOXL1-AS1的表達使用RNAiso Plus試劑(Takara，大連，中國)從胃癌組織及癌旁正常組織中分別提取總RNA。根據(jù)試劑盒使用說明書，使用cDNA合成試劑盒(Takara，大連，中國)合成第一鏈cDNA，采用ABI Prism 7500實時熒光定量PCR儀實時PCR檢測LOXL1-AS1表達水平，以GAPDH為內(nèi)參。每20 μl反應體系內(nèi)加入400 ng cDNA、10 μl TB Green series(Takara，大連，中國)、正反鏈引物各0.6 μl及6.88 μl RNase-free ddH2O。qRT-PCR實驗條件為95 ℃ 15 min 預變性，95 ℃ 10 s、56 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s 重復40 個循環(huán)。引物及探針序列如下：LOXL1-AS1引物：Forward：5′-GATATGTTGGATGATGGA-3′，Reverse：5′-GATATGTTGGATGGATGA-3′；GAPDH引物：Forward：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，Reverse： 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。使用比較循環(huán)閾值(Ct)計算基因的相對表達(2-△△Ct)，實驗重復3次。

1.3 利用Kaplan Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析LOXL1-AS1表達水平與胃癌患者預后的相關性目前Kaplan Meier plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)提供了631例胃癌患者的基因表達結(jié)果和生存資料，使用者可利用該數(shù)據(jù)庫實現(xiàn)目的基因表達水平與腫瘤患者總生存期(overall survival，OS)的相關性[15]。數(shù)據(jù)分析條件設定：(1)腫瘤類型：Gastric cancer；(2)目的基因：LOXL1-AS1；其他設定為數(shù)據(jù)庫默認設定。觀察指標為LOXL1-AS1表達結(jié)果、不同LOXL1-AS1表達下胃癌患者的總生存曲線。生存比較采用風險比(HR)及其95%CI和相應P值。

1.4 統(tǒng)計學分析采用Graphpad Prism統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料兩組間比較采用t檢驗；LOXL1-AS1的表達與胃癌臨床病理指標的相關性分析采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并進行Log-Rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LOXL1-AS1在胃癌組織及癌旁組織中的表達情況采用qRT-PCR檢測武漢大學人民醫(yī)院89對胃癌組織和癌旁組織樣本中LOXL1-AS1基因表達水平，數(shù)據(jù)分析顯示，胃癌組織中LOXL1-AS1表達量為3.98±2.24，癌旁組織中的表達量為2.20±1.18，胃癌組織中LOXL1-AS1表達量顯著高于癌旁組織(P<0.001)(見圖1)。

圖1 lncRNA LOXL1-AS1在89對胃癌組織及癌旁組織中的表達情況

Fig 1 The expression of lncRNA LOXL1-AS1 in 89 pairs of gastric cancer tissues and adjacent tissues

2.2 LOXL1-AS1的表達與胃癌患者的腫瘤病理指標相關性為了明確LOXL1-AS1在胃癌發(fā)生和發(fā)展中的作用和相關影響因素，繼而分析89例患者LOXL1-AS1表達與其各腫瘤病理指標的相關性(見表1)。χ2檢驗提示，腫瘤組織中LOXL1-AS1高表達與胃癌患者的腫瘤直徑增加(P=0.0165)、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.0065)、遠處轉(zhuǎn)移陽性(P=0.0084)和TNM分期增加(P=0.0041)密切相關，但與年齡、性別、腹膜轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度等無相關性(P>0.05)，提示LOXL1-AS1可能促進胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

表1 89例胃癌患者臨床病理指標與LOXL1-AS1表達水平的相關性 [n(%)]Tab 1 Correlation between clinicopathological parameters and expression of LOXL1-AS1 in 89 gastric cancer patients [n(%)]

2.3 LOXL1-AS1表達量與患者長期預后的關系我們使用Kaplan Meier plotter數(shù)據(jù)庫(http：//kmplot.com/analysis/)分析了LOXL1-AS1表達水平與胃癌患者預后的相關性。納入分析的631例胃癌組織中，455例為高表達組，176例為低表達組。生存分析結(jié)果顯示，LOXL1-AS1高表達組胃癌患者生存率顯著低于LOXL1-AS1低表達組，差異有統(tǒng)計學意義(HR=1.52，95%CI：1.17～1.97，P=0.0014)。表明高水平的LOXL1-AS1與胃癌患者的低總生存時間密切相關(見圖2)。

圖2 不同LOXL1-AS1表達狀態(tài)的總生存曲線圖Fig 2 The overall survival curves of different LOXL1-AS1 expression states

3 討論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多基因參與的過程。lncRNA是生物過程中的重要調(diào)節(jié)劑，可在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平等層面調(diào)控基因的表達，并通過充當致癌基因或腫瘤抑制因子在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。LOXL1-AS1在多種腫瘤中異常表達并影響腫瘤進展。如LOXL1-AS1可調(diào)節(jié)髓母細胞瘤的增殖，并促進細胞侵襲、轉(zhuǎn)移[14]；LOXL1-AS1可促進骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲[16]。LOXL1-AS1在胃癌中的作用尚不明確，本研究旨在觀察LOXL1-AS1在胃癌組織中的表達，并探討其與胃癌生物學行為和臨床病理特征的關系。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，LOXL1-AS1在胃癌組織中表達顯著上調(diào)，且其高表達與多項不良臨床特征，包括腫瘤直徑、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關。這些結(jié)果提示，LOXL1-AS1在胃癌進展中具有重要作用，并可能主要發(fā)揮了促癌的作用。

我們進一步利用公開的Kaplan Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析了LOXL1-AS1表達水平與胃癌患者預后的相關性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LOXL1-AS1高表達組胃癌患者生存率顯著低于LOXL1-AS1低表達組患者，差異有統(tǒng)計學意義。表明高水平的LOXL1-AS1與胃癌患者的低總生存時間密切相關，提示LOXL1-AS1表達水平的高低可能預測胃癌患者的預后。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，LOXL1-AS1在胃癌中的表達水平顯著高于癌旁組織，且LOXL1-AS1在胃癌中的高表達與腫瘤直徑、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期和患者預后密切相關。LOXL1-AS1可能參與了胃癌發(fā)生、發(fā)展過程，并可能作為預測胃癌患者預后評估的指標。但其是否可作為評估胃癌患者預后的獨立影響因素還需進一步大樣本數(shù)據(jù)研究證實。我們將在細胞和動物模型中進一步探討LOXL1-AS1在胃癌中的生物學功能。