杜雪蓮， 張美英， 郭明洲

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100853

食管癌是全球第七大常見(jiàn)的腫瘤，也是與癌癥相關(guān)死亡的第六大主要原因[1]。由于食管癌早期癥狀不典型，盡管目前診斷方法和技術(shù)已有所進(jìn)步，但大多數(shù)患者確診時(shí)已屬于晚期，不能進(jìn)行手術(shù)切除治療，其5年生存率約為15%[2]。 因此，尋找新的食管癌診斷標(biāo)志物及治療靶標(biāo)有望提高早期診斷率和治療效果，改善食管癌預(yù)后[2-3]。

隨著人類基因組測(cè)序的完成，發(fā)現(xiàn)蛋白編碼序列僅占整個(gè)基因組序列的2 %以下[4]，僅依據(jù)基因組序列的改變無(wú)法解釋腫瘤等復(fù)雜疾病的機(jī)制。表觀遺傳在食管癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用和機(jī)制越來(lái)越受到人們的重視[5]， DNA甲基化在食管癌早期診斷、預(yù)后和化療敏感性檢測(cè)方面的研究已有大量報(bào)道[6-11]。非編碼RNA，特別是長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，lncRNA)在增殖、細(xì)胞周期、凋亡、分化、侵襲、遷移等生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。lncRNA在食管癌中的研究也有部分報(bào)道[13-15]。本文就lncRNA2在食管癌中的表達(dá)情況作一研究。

1 材料與方法

1.1 食管癌組織和細(xì)胞系從中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院收集了43例食管癌及其距癌組織2 cm以上的配對(duì)正常癌旁組織。所有樣品的收集均基于中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的批準(zhǔn)和指南。標(biāo)本來(lái)源的所有患者術(shù)前均未接受任何放化療等治療手段。標(biāo)本采集過(guò)程按照規(guī)范嚴(yán)格執(zhí)行，獲得患者知情同意。臨床分期依據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)第8版食管癌TNM分期。在本研究中使用了14種食管癌細(xì)胞系，包括KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE450、KYSE520、COLO 680N、TE1、TE3、TE7、TE13、BIC1、YES2、HET細(xì)胞。所有細(xì)胞系均從原發(fā)性食管癌建立，并在質(zhì)量濃度為100 mg/L胎牛血清和90% RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen，CA，美國(guó))中培養(yǎng)。當(dāng)在75 cm2的培養(yǎng)瓶(NEST Biotechnology，江蘇，中國(guó))中達(dá)到總匯合1×106個(gè)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞以1∶3傳代。

1.2 RNA分離、逆轉(zhuǎn)錄和半定量RT-PCR使用Trizol試劑(美國(guó)生命技術(shù)公司)提取總RNA，通過(guò)分光光度計(jì)進(jìn)行定量，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

根據(jù)制造商的說(shuō)明(美國(guó)Invitrogen公司)合成了第1鏈cDNA?？偣彩褂? μg RNA合成第1鏈cDNA，并稀釋至100 μl。隨后，將2.5 μl稀釋的cDNA混合物用于最終25 μl反應(yīng)體積中的PCR擴(kuò)增。lncRNA2的PCR引物序列如下：5′-GAGGCCAAATAGGTGGTTTCAGC-3′(F);5′-TGGCTTTCGCTC

TGGGACAT-3′(R)。 PCR擴(kuò)增進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物長(zhǎng)度為122 bp。 GAPDH的引物序列如下：5′-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(F)和5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(R)。作為內(nèi)部對(duì)照，GAPDH擴(kuò)增了25個(gè)循環(huán)，用質(zhì)量濃度為2 g/L瓊脂糖凝膠檢查擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。RT-PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃，5 min，1 cycle；95 ℃，30 s，64 ℃，30 s，72 ℃，40 s，3 cycles；95 ℃，30 s，61 ℃，30 s，72 ℃，40 s，3 cycles；95 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，40 s，3 cycles；95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，40 s，26 cycles。

1.3 lncRNA芯片技術(shù)博奧晶典公司的lncRNA表達(dá)芯片表達(dá)技術(shù)，覆蓋NCBI、RNAdb、Refseq、UCSC Known、Gene等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)14對(duì)配對(duì)的食管癌組織和癌旁組織進(jìn)行分析，獲得差異表達(dá)>10倍的lncRNA 134個(gè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 食管癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、吸煙史、飲酒史、家族史與lncRNA2表達(dá)情況的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA2在食管癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯增加lncRNA2在KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE450、KYSE520、COLO680N、TE3、YES2、BIC1細(xì)胞中高表達(dá)，在TE1、TE7、TE13、HET細(xì)胞中缺失表達(dá),表明lncRNA2在食管癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯增加 (見(jiàn)圖1)。

2.2 lncRNA2在食管癌組織中的表達(dá)明顯增加在43對(duì)配對(duì)的食管癌及癌旁組織中， lncRNA2在26例癌組織中高表達(dá)，而在癌旁組織中缺失表達(dá)或低表達(dá)；11例在癌組織中缺失表達(dá)或低表達(dá)，而在癌旁組織中高表達(dá)，另外6例在癌組織和癌旁組織中均缺失表達(dá)(見(jiàn)圖2)。

lncRNA2在60.47%(26/43)的食管癌組織中高表達(dá)，而在25.58%(11/43)的癌旁組織中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

lncRNA2高表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、吸煙史、飲酒史、家族史等臨床因素均無(wú)相關(guān)性(P均>0.05)(見(jiàn)表1)。

圖1 lncRNA2在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況 Fig 1 The expression of lncRNA2 in esophageal

注：C：癌組織；N：癌旁組織。

Fig 2 The expression of lncRNA2 in esophageal cancer tissues

續(xù)表1

因素例數(shù)高表達(dá)(n=26)低表達(dá)(n=17)P值 有1376 無(wú)301911飲酒史1.000 有642 無(wú)372215家族史1.000 有1174 無(wú)321913

3 討論

食管癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。盡管在腫瘤遺傳方面進(jìn)行了大量研究，但目前尚未發(fā)現(xiàn)食管癌相關(guān)的突變熱點(diǎn)[16-19]。在表觀遺傳方面的研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有甲基化的累積性改變，且DNA甲基化與食管癌的預(yù)后和化療敏感性密切相關(guān)[20-23]。關(guān)于lncRNA在食管癌中的研究報(bào)道較少，我們過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn),lncRNA gadd7在食管癌中通過(guò)與TDP-43的相互作用而調(diào)控Cdk6 mRNA的代謝[24]。我們通過(guò)lncRNA芯片技術(shù)篩選出一批新的在食管癌中異常表達(dá)的lncRNA。其中，lncRNA2定位于5號(hào)染色體， 其表達(dá)在食管癌中明顯升高，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。lncRNA2是食管癌潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。