王 勤，蘇小茉，郭明洲

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000； 2.中國人民解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)科

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在全球分別位居第7位和第6位。食管癌具有地域性分布的特點[1]。在我國，食管癌高發(fā)于太行山地區(qū)，農(nóng)村地區(qū)食管癌發(fā)病率高于城市[2]。食管癌的主要病理類型為鱗狀細(xì)胞癌和腺癌，在食管癌高發(fā)區(qū)，主要的病理類型為鱗狀細(xì)胞癌，而在西方國家主要為腺癌[3-4]。種族、性別、吸煙、飲酒、胃食管反流病、飲食、營養(yǎng)失衡、遺傳因素是食管癌發(fā)生的主要危險因素[5]。近年的研究表明，環(huán)境因素引起的遺傳和表觀遺傳學(xué)改變在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[4]。

抑癌基因啟動子區(qū)高甲基化和基因組范圍低甲基化被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要原因[6]。P15、P16、BRCA1、MGMT和DAPK1等基因在不同腫瘤中均發(fā)生甲基化而表達(dá)沉默[6-8]。

DAPK、P16、MGMT、MLH1、RARβ2、HIN1、TFPI-2、DACH1和SOX17等基因均發(fā)現(xiàn)在食管癌及其癌前病變中頻繁發(fā)生甲基化。而CHFR甲基化發(fā)生在較晚期，CHFR甲基化患者對紫杉烷類藥物敏感性增加。FHIT甲基化與食管鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后不良有關(guān)[9]。這些結(jié)果表明，腫瘤相關(guān)基因DNA甲基化可能成為食管癌早期診斷、預(yù)后和化療敏感的標(biāo)志物。

連接黏附分子(JAMs)屬于免疫球蛋白超家族，已被證明與上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)，對于建立和維護(hù)細(xì)胞極性至關(guān)重要。在腫瘤發(fā)展過程中，緊密連接被重塑，腫瘤細(xì)胞能夠擺脫細(xì)胞間連接的限制，促進(jìn)腫瘤的遷移[10]。連接黏附分子-3(JAM3)是JAM家族中的一員，又稱連接黏附分子-C(JAMC)，Mandicourt 等證明JAM3可以改善肺癌細(xì)胞發(fā)育過程中的緊密連接屏障[10-11]。JAM3基因與垂體腺瘤的侵襲性有一定相關(guān)性[12]。在胃腺癌中JAM3基因的表達(dá)下調(diào)，可能參與了胃腺癌的發(fā)生[13]。JAM3在宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌中均發(fā)生高甲基化，且甲基化水平與CIN的預(yù)后密切相關(guān)[14-15]。最近研究發(fā)現(xiàn)，JAM3在結(jié)腸癌中頻繁發(fā)生甲基化，且JAM3在結(jié)腸癌中為抑癌基因[16]。JAM3基因在食管癌中的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本文就JAM3基因啟動子區(qū)在食管癌中的甲基化情況及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制作一分析。

1 材料與方法

1.1 食管癌細(xì)胞系本實驗所采用的食管癌細(xì)胞系KYSE410、KYSE150、KYSE520、COLO680N、KYSE140、KYSE450 和TE13均為已建立的人原發(fā)性食管癌來源的細(xì)胞。

1.2 組織標(biāo)本83例原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本來源于2009年8月至2011年6月收集的新鮮組織標(biāo)本(中國人民解放軍總醫(yī)院)。5例正常食管黏膜組織來源于非腫瘤患者食管黏膜。取材的所有患者術(shù)前均未接受任何放化療等治療。臨床分期依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會第8版食管癌TNM分期。本研究獲得中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。標(biāo)本采集過程按照規(guī)范嚴(yán)格執(zhí)行，獲得患者知情同意。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞置于質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2及飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，每1～2 d更換1次培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長為80%～90%融合時，按照1∶3傳代接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中。

1.3.2 細(xì)胞5-Aza-dc處理：對數(shù)生長期的食管癌細(xì)胞，按照1∶3比例傳代，12 h后更換濃度為2 μmol/L的5-Aza-dc(Sigma)RPMI-1640培養(yǎng)基，每24 h換液，共處理96 h，處理結(jié)束后提取RNA。

1.3.3 組織及細(xì)胞DNA與總RNA的提取：常規(guī)酚氯仿法抽提DNA，乙醇沉淀后溶于TE緩沖液。用Trizol (Invitrogen公司)提取總的RNA，紫外分光光度計檢測濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸質(zhì)量，經(jīng)篩選后分別置于-20 ℃(DNA)與-80 ℃(RNA)儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 半定量RT-PCR檢測：取5 μg總RNA用cDNA第一鏈合成試劑盒(Invitrogen公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋5倍后取2.5 μl為模板在25 μl反應(yīng)體系擴(kuò)增。JAM3引物序列為：5′-ACGGATTCCAGAGCCAATC-3′(forward)和5′-CGCCAATGTTCAGGTCATAG-3′(reverse)，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為187 bp，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，3 cycles；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，3 cycles；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，3 cycles；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，25 cycles；72 ℃ 7 min。雙蒸餾水(ddH2O)作為空白對照，排除體系污染。GAPDH作為參照檢測cDNA質(zhì)量，其引物序列為：5′-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(forward)和5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(reverse)，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為454 bp，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，25 cycles；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.5 甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)：2 μg細(xì)胞或組織DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉處理，Wizard DNA clean-up純化DNA后溶于20 μl ddH2O儲存于-80 ℃?zhèn)溆?。JAM3啟動子區(qū)特異性甲基化引物序列為：5′-AGAATTTATGTGTCGGTTTAGAGTATC-3′(M-forward)和5′-CCGCCCCAATTACCATAACGACCG-3′(M-reverse)；擴(kuò)增產(chǎn)物長度為118 bp。啟動子區(qū)特異性非甲基化引物序列為：5′-GAGAATTTATGTGTTGGTTTA-GAGTATT-3′(U-forward)和5′-ACCCACCCCAATTACCATAACAACCA-3′(U-reverse)；擴(kuò)增產(chǎn)物長度為121 bp。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35 cycles；72 ℃ 7 min。體外甲基化DNA(in vitro methylated DNA，IVD)作為甲基化對照，正常人外周血淋巴細(xì)胞(normal lymphocyte，NL)DNA作為非甲基化對照，ddH2O作為陰性對照。取MSP擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，質(zhì)量濃度為20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，食管癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、腫瘤位置、吸煙史、飲酒史、家族史與JAM3啟動子區(qū)甲基化的關(guān)系采用χ2檢驗進(jìn)行單因素分析,檢驗水準(zhǔn)α=0.05；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 JAM3在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況JAM3在KYSE520、KYSE140、KYSE450細(xì)胞中高表達(dá)，在KYSE410、COLO680N、TE13、KYSE150細(xì)胞中表達(dá)缺失。經(jīng)過5-Aza-dc處理后，KYSE520、KYSE140、KYSE450細(xì)胞中JAM3表達(dá)水平不變，KYSE150、KYSE410、COLO680N、TE13細(xì)胞中JAM3表達(dá)恢復(fù)(見圖1A)。

2.2 食管癌細(xì)胞系中JAM3基因啟動子區(qū)甲基化情況JAM3基因啟動子區(qū)在KYSE520、KYSE140、KYSE450細(xì)胞中表現(xiàn)為非甲基化；在KYSE150、KYSE410、TE13、COLO680N細(xì)胞中呈完全甲基化狀態(tài)(見圖1B)。

2.3 原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌組織中JAM3基因啟動子區(qū)的甲基化情況原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌組織中JAM3的甲基化率為50.6%(42/83)，而正常食管黏膜組織中JAM3均為非甲基化(0/5)(見圖2)。

2.4 JAM3甲基化與原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌臨床因素的關(guān)系JAM3 啟動子區(qū)甲基化與原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌病灶的位置相關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、TNM 分期、腫瘤大小、吸煙史、飲酒史、家族史無相關(guān)性(P>0.05,見表1)。

圖1 JAM3在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)及甲基化狀態(tài)A：5-Aza-dc處理前后食管癌細(xì)胞系中JAM3的表達(dá)情況；B：MSP檢測食管癌細(xì)胞系JAM3基因啟動子區(qū)甲基化情況

Fig 1 The expression and methylation status of JAM3 in esophageal cancer cellsA: expression of JAM3 analyzed before and after 5-Aza-dc treatment in esophageal cancer cell lines; B: promoter region methylation of JAM3 in esophageal cancer cell lines detected by MSP

注：M：甲基化；U：非甲基化。EN1～EN5：正常食管黏膜組織；EC1～EC16：原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌組織。

表1 JAM3甲基化與原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌臨床因素的關(guān)系 Tab 1 The association of JAM3 methylation with clinical factors in primary esophageal squamous cell carcinoma

續(xù)表1

臨床因素例數(shù) 甲基化(n=42)非甲基化(n=41)P值 ≥5 cm301614TNM分期△ 1.000 Ⅰ～Ⅱ542727 Ⅲ～Ⅳ281414腫瘤位置 0.049 胸上段21138 胸中段432419 胸下段19514吸煙史 0.444 無522824 有311417飲酒史 0.951 無633231 有201010家族史 0.247 無602832 有23149

注：*：2例患者腫瘤大小數(shù)據(jù)缺失；△：1例患者腫瘤TNM分期數(shù)據(jù)缺失，均未記入統(tǒng)計學(xué)分析。

3 討論

JAM3是JAM家族的成員之一，由兩個Ig樣結(jié)構(gòu)域組成，在其羧基端有一個PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點，與上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)[10, 17]。Guo等[15]收集139例CIN患者隨訪24個月，發(fā)現(xiàn)JAM3甲基化與CIN的進(jìn)展有關(guān)。結(jié)直腸癌組織的甲基化與腫瘤TNM分期顯著相關(guān)[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，JAM3在原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌中50.6%發(fā)生甲基化，其甲基化與腫瘤的位置相關(guān)， 而與年齡、性別、TNM 分期、腫瘤大小、吸煙史、飲酒史、家族史無關(guān)。進(jìn)一步明確JAM3在食管癌中的表達(dá)受啟動子區(qū)甲基化的調(diào)控。該研究的局限性是檢測的樣本量較小，增加樣本量進(jìn)一步研究有望獲得更多的信息。另外，該研究對JAM3在食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的功能未進(jìn)行深入研究，今后擬對其功能和作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，以獲得可能的治療靶標(biāo)。