孟玉娟， 亓 民， 馬 軍， 袁 翎， 任凱凱， 馬佳康， 侯明宇， 張中冕

1.鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，河南 洛陽 471009； 2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 鄭州大學(xué)消化疾病研究所； 3.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科； 4.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國常見惡性腫瘤之一，盡管內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展提高了診療效果，但根據(jù)2019年中國腫瘤登記年報(bào)統(tǒng)計(jì)，其發(fā)病率排第6位，死亡率排第4位[1]。

免疫學(xué)的發(fā)展揭示了機(jī)體免疫功能平衡和腫瘤發(fā)生的相關(guān)性，免疫相關(guān)基因?qū)盒阅[瘤的預(yù)后有預(yù)測(cè)作用，一些調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫功能的藥物如PD-1、CTLA4單抗及免疫細(xì)胞治療技術(shù)，已在臨床上取得了較好的效果[2]。利用免疫細(xì)胞浸潤分析方法發(fā)現(xiàn)，ESCC中9個(gè)免疫相關(guān)基因被認(rèn)為是預(yù)測(cè)預(yù)后的因素，與ESCC患者的總生存率密切相關(guān)[3]，低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者中發(fā)現(xiàn)8個(gè)預(yù)后關(guān)鍵基因[4]；免疫細(xì)胞浸潤的程度和分布也與乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌的總生存率相關(guān)[5-7]。然而，關(guān)于ESCC免疫浸潤之間關(guān)系的研究還很有限。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的ESCC測(cè)序數(shù)據(jù)，分析免疫細(xì)胞浸潤和免疫相關(guān)基因，篩選用于預(yù)測(cè)ESCC患者預(yù)后的免疫相關(guān)基因。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)下載從TCGA數(shù)據(jù)庫(http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga)中下載ESCC轉(zhuǎn)錄組FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)、Counts數(shù)據(jù)以及臨床數(shù)據(jù)。

1.2 單樣本基因集富集分析(single sample GSEA，ssGSEA)利用R軟件中“GSVA”包對(duì)ESCC的FPKM數(shù)據(jù)進(jìn)行處理得到每個(gè)樣品中29種免疫相關(guān)基因集(免疫基因集包括免疫細(xì)胞類型、功能和通路)評(píng)分，根據(jù)ssGSEA的結(jié)果，使用“hclust”(R包)將ESCC腫瘤樣本進(jìn)行免疫浸潤分組(分為低、高和中等免疫組)。

1.3 分組效果的驗(yàn)證基于ESCC的FPKM轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)，通過ESTIMATE算法得到每個(gè)樣本的基質(zhì)、免疫、ESTIMATE評(píng)分和腫瘤純度，驗(yàn)證ssGSEA分組的效果。同時(shí)分析各免疫浸潤組中人白細(xì)胞相關(guān)抗原(HLA)和程序性死亡配體1(PD-L1)的基因表達(dá)水平用于分組效果再驗(yàn)證。

1.4 加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted correlation network analysis，WGCNA)根據(jù)|log2FC|>1和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05的標(biāo)準(zhǔn)，利用R軟件“edger”軟件包對(duì)ESCC的mRNA Counts數(shù)據(jù)進(jìn)行mRNA差異分析。結(jié)合免疫浸潤分組，對(duì)差異表達(dá)mRNA，利用R軟件“WGCNA”軟件包進(jìn)行加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析篩選免疫最相關(guān)模塊，根據(jù)性狀與模塊基因的相關(guān)性(gene significance，GS)>0.3以及基因與模塊的相關(guān)性(module membership，MM)>0.8篩選模塊中的免疫相關(guān)的hub基因以進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.5 生存分析利用ESCC患者的生存時(shí)間以及狀態(tài)數(shù)據(jù)結(jié)合hub基因的表達(dá)情況，通過R軟件“survminer”包中的surv_cutpoint函數(shù)選擇最佳的cut-off值并進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析以比較hub基因表達(dá)的總生存期(OS)差異，篩選出與生存相關(guān)的hub基因。

1.6 GO(Gene Ontology)富集和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析對(duì)最相關(guān)模塊中的基因利用R軟件“Cluster Profiler”包進(jìn)行GO及KEGG富集分析，篩選出模塊相關(guān)的功能及通路。

2 結(jié)果

2.1 ESCC樣本的免疫分組及驗(yàn)證使用ssGSEA算法分析了TCGA ESCC樣本在29個(gè)免疫浸潤數(shù)據(jù)集中的評(píng)分，用層次聚類的方法將81例腫瘤樣本分為高免疫組(14例)、中等免疫組(46例)及低免疫組(21例)(見圖1)。為了驗(yàn)證上述分組策略的可行性，基于ESCC的FPKM表達(dá)譜數(shù)據(jù)使用ESTIMATE算法計(jì)算基質(zhì)、免疫、ESTIMATE評(píng)分和腫瘤純度。隨著樣本免疫性的增加，腫瘤純度降低，基質(zhì)、免疫和ESTIMATE評(píng)分逐漸升高(見圖2A)。4項(xiàng)評(píng)分在3組中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2B)。此外，ESCC中HLA相關(guān)基因和PD-L1基因表達(dá)水平在高免疫組與中等免疫組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2C～D)。

2.2 免疫相關(guān)hub基因的篩選利用ESCC轉(zhuǎn)錄組mRNA Counts數(shù)據(jù)篩選差異mRNA，下載的數(shù)據(jù)包括ESCC樣本81例及癌旁樣本11例(非完全為ESCC配對(duì)癌旁樣本，10例為食管腺癌配對(duì)樣本)。共篩選到4 867個(gè)差異mRNAs，根據(jù)81例樣本的免疫浸潤分組，結(jié)合差異基因表達(dá)量行WGCNA分析，將基因分為17個(gè)模塊，其中與免疫分組最相關(guān)的為brown模塊(cor=-0.73，P=5e-14)(見圖3A)。根據(jù)MM>0.8及GS>0.3的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)模塊中的基因進(jìn)行過濾，共篩選到6個(gè)hub基因，分別為HAVCR2、CCL4、FPR3、SLAMF8、SAMSN1、SLC15A3(見圖3B)。

2.3 hub基因的生存分析基于ESCC臨床數(shù)據(jù)以及6個(gè)hub基因的表達(dá)量，通過R軟件“survminer”包中的surv_cutpoint函數(shù)選擇最佳的cut-off值，發(fā)現(xiàn)HAVCR2與患者OS相關(guān)，HAVCR2的表達(dá)量越高，患者的OS越短(見圖4)。

注：聚類1(綠色)、聚類2(紅色)和聚類3(藍(lán)色)分別代表高免疫組、中等免疫組和低免疫組。

注：Immunity-L:低免疫組；Immunity-M: 中等免疫組；Immunity-H:高免疫組。* *P<0.01，* * *P<0.001，ns：差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 分組效果的驗(yàn)證A：熱圖顯示使用ESTIMATE算法得到的基質(zhì)、免疫、ESTIMATE評(píng)分和腫瘤純度在免疫浸潤分組之間的比較；B：小提琴圖表示其在免疫浸潤分組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；C～D：箱形圖顯示了免疫浸潤分組中HLA和PD-L1的差異表達(dá)

Fig 2 Verification of grouping effectA: the thermogram showed the comparison of matrix, immunity, ESTIMATE score and tumor purity between immune infiltration groups using the ESTIMATE algorithm; B: Violin chart showed the statistical difference between groups with immune infiltration; C-D: the box diagram showed the differential expressions of HLA and PD-L1 in the immune infiltration groups

圖3 hub基因的篩選 A：不同模塊與免疫表型之間相關(guān)性的熱圖；B：brown模塊中GS和MM相關(guān)性分析散點(diǎn)圖Fig 3 Screening of hub gene A: thermogram of correlation between different modules and immunophenotypes; B: scatter diagram of GS and MM correlation analysis in brown module

圖4 HAVCR2的生存分析圖Fig 4 Survival analysis chart of HAVCR2

2.4 GO富集和KEGG分析對(duì)最相關(guān)模塊中的基因進(jìn)行富集分析，GO富集結(jié)果顯示，該模塊與趨化因子受體結(jié)合、趨化因子活性、G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合、免疫球蛋白結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、CCR趨化因子受體結(jié)合、IgG結(jié)合、受體配體活性、CXCR趨化因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、糖胺聚糖結(jié)合、碳水化合物結(jié)合等功能相關(guān)(見圖5A)。KEGG富集結(jié)果提示，該模塊中基因可能參與病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、Toll樣受體信號(hào)通路等(見圖5B)。

圖5 Brown模塊的GO富集結(jié)果及KEGG富集結(jié)果 A：GO富集結(jié)果；B：KEGG富集結(jié)果Fig 5 GO enrichment results and KEGG results of brown module A: GO enrichment results; B: KEGG enrichment results

3 討論

早期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，腫瘤灶浸潤淋巴細(xì)胞的多少與預(yù)后有關(guān)，隨著腫瘤免疫相關(guān)機(jī)制的深入研究，一些靶向免疫機(jī)制的藥物已經(jīng)在臨床應(yīng)用，并取得了一定的療效，但是臨床上期待發(fā)現(xiàn)更多特異性診療靶點(diǎn)。雖然ESCC的診斷和治療技術(shù)已經(jīng)在全球范圍內(nèi)得到了改進(jìn)，但還未發(fā)現(xiàn)可靠的免疫治療方案，越來越多的研究報(bào)道免疫浸潤與ESCC的預(yù)后密切相關(guān)[7-12]。

文獻(xiàn)報(bào)道，利用基因芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)9個(gè)免疫相關(guān)基因與ESCC患者的總生存率相關(guān)[3]。但是，利用生物信息學(xué)技術(shù)可以更有效地利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫信息，是探索腫瘤發(fā)病機(jī)制的常用方法之一，在腫瘤免疫浸潤和免疫分型方面的應(yīng)用逐漸增多。在乳腺癌中，基于ssGSEA和WGCNA分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)免疫相關(guān)基因被鑒定為預(yù)后的生物標(biāo)志物[13]。本研究中，利用ssGSEA分析，構(gòu)建ESCC免疫分型，將TCGA數(shù)據(jù)庫中的ESCC標(biāo)本分為低、中、高免疫浸潤組。并發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)基因HAVCR2、CCL4、FPR3、SLAMF8、SAMSN1、SLC15A3可能與ESCC免疫調(diào)控有關(guān)。進(jìn)一步的預(yù)后分析，從上述基因中找到和預(yù)后相關(guān)的HAVCR2，該基因可能通過細(xì)胞因子相互作用，參與ESCC的發(fā)生和發(fā)展。

HAVCR2基因，也叫TIM3，是TIM家族中具有共同基序的Ⅰ型跨膜糖蛋白，參與機(jī)體天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)。TIM3可抑制免疫細(xì)胞功能，誘導(dǎo)T細(xì)胞、NK細(xì)胞的凋亡，參與腫瘤免疫抑制。還可以可溶性方式分泌到細(xì)胞外[14]。國內(nèi)文獻(xiàn)也已經(jīng)報(bào)道，TIM3基因的過表達(dá)與ESCC的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[15-16]。

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展，多種生物信息學(xué)方法被用來篩選預(yù)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)。篩選出的6個(gè)免疫相關(guān)基因可能在ESCC發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，尤其是TIM3基因。針對(duì)這些基因的進(jìn)一步研究，探明其在ESCC中的重要作用，可能會(huì)為ESCC增添新的診療靶點(diǎn)。