金 山，王月嬋

（1.新賓滿族自治縣自然資源發(fā)展中心，遼寧 撫順113200；2.遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院，遼寧 沈陽(yáng)110032）

橡實(shí)是櫟樹果實(shí)的統(tǒng)稱。我國(guó)櫟樹品種較多，根據(jù)地區(qū)劃分為北櫟和南櫟。北櫟主要包括遼東櫟和蒙古櫟，南櫟主要為高山櫟、青岡櫟和柞櫟等品種。蒙古櫟在北方種植面積廣，全國(guó)達(dá)100萬(wàn)hm2，其生存能力及繁殖能力強(qiáng)，蒙古櫟橡實(shí)的產(chǎn)量頗高。蒙古櫟橡實(shí)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，是有待精深開發(fā)的重要經(jīng)濟(jì)植物資源。蒙古櫟橡實(shí)的主要成分是淀粉和蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量達(dá)15%。近年，蒙古櫟橡實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分的開發(fā)逐漸受到重視，已有報(bào)道利用橡實(shí)加工淀粉，生產(chǎn)動(dòng)物飼料及開發(fā)橡實(shí)醬等食品。然而橡實(shí)中高含量的蛋白并未得到充分的開發(fā)利用。由于橡實(shí)在我國(guó)屬于半野生植物資源，國(guó)內(nèi)對(duì)橡實(shí)中營(yíng)養(yǎng)成分的研究還不充分，造成橡實(shí)資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。因此，本研究利用酶解法對(duì)橡實(shí)蛋白進(jìn)行提取，結(jié)合單因素及正交試驗(yàn)方法進(jìn)行分析，對(duì)蒙古櫟橡實(shí)蛋白的提取工藝進(jìn)行研究，為提高蒙古櫟橡實(shí)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，開發(fā)功能性蛋白食品提供科學(xué)依據(jù)［1］。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為蒙古櫟橡實(shí)，于2018年10月5日采自吉林省吉林市經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)吉祥路韓豐食品有限公司。置于常溫瓦楞紙殼箱子轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，放置于通風(fēng)陰涼處備用。

將蒙古櫟橡實(shí)脫脂制成橡實(shí)粕，備用；木瓜蛋白酶（50 萬(wàn)U·g-1），中性蛋白酶（6 000 U·g-1），堿性蛋白酶（10 萬(wàn)U·g-1），牛血清白蛋白（Bio Basic 公司，純度98%）等均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：大連格萊瑞機(jī)械有限責(zé)任公司；TU-1810 紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器責(zé)任有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CR21G 冷凍離心機(jī)：日立有限公司；85-2恒溫磁力攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司等。

1.3 方 法

1.3.1 蒙古櫟橡實(shí)蛋白提取流程

稱取一定質(zhì)量橡實(shí)，脫皮后干燥粉碎，用7倍體積正己烷對(duì)橡實(shí)粉進(jìn)行脫脂處理，將橡實(shí)粉過40目篩，得脫脂橡實(shí)干粉。稱取一定質(zhì)量脫脂橡實(shí)粉，按一定比例添加磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液（pH=7），調(diào)節(jié)pH 值及溫度后，以4 000 r·min-1離心20 min，收集上清液，然后調(diào)節(jié)pH 值至等電點(diǎn)沉淀蛋白，干燥，得橡實(shí)水解蛋白。

1.3.2 蒙古櫟橡實(shí)蛋白提取率測(cè)定方法

采用Folin-酚法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，原料蛋白質(zhì)含量用凱氏定氮法測(cè)定［2-3］。

橡實(shí)粕水解蛋白提取率=（上清液蛋白質(zhì)含量/原料蛋白質(zhì)含量）×100%

1.3.3 蒙古櫟橡實(shí)蛋白提取酶的比較

準(zhǔn)確稱取脫脂橡實(shí)粕凍干粉5 g，按照1︰5 的料液比將橡實(shí)粕凍干粉配置成水解液，向水解液中添加1%的木瓜蛋白酶，將其pH 值調(diào)節(jié)到6.0，轉(zhuǎn)移到60 ℃下水解2.5 h 后加熱到90 ℃，滅活木瓜蛋白酶15 min，轉(zhuǎn)移至室溫冷卻后，離心取上清液凍干測(cè)定蛋白提取率。

準(zhǔn)確稱取脫脂橡實(shí)粕凍干粉5 g，按照1︰5 的料液比將橡實(shí)粕凍干粉配置成水解液，向水解液中添加1%中性蛋白酶，將其pH 值調(diào)節(jié)到7.0，轉(zhuǎn)移到40 ℃下水解2.5 h 后加熱到90 ℃，滅活中性蛋白酶15 min，轉(zhuǎn)移至室溫冷卻后，離心取上清液凍干測(cè)定蛋白提取率。

準(zhǔn)確稱取脫脂橡實(shí)粕凍干粉5 g，按照1︰5 的料液比將橡實(shí)粕凍干粉配置成水解液，向水解液中添加1%堿性蛋白酶，將其pH 值調(diào)節(jié)到10.0，轉(zhuǎn)移到45 ℃下水解2.5 h 后加熱到90 ℃，滅活堿性蛋白酶15 min，轉(zhuǎn)移至室溫冷卻后，離心取上清液凍干測(cè)定蛋白提取率。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取橡實(shí)粕凍干粉5 g，以蛋白提取率為考察指標(biāo)，以加酶量、pH 值、溫度及時(shí)間為考察對(duì)象，分析4種不同因素對(duì)蛋白提取率的影響。單因素試驗(yàn)水平如表1。

表1 單因素試驗(yàn)水平表

1.3.5 正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為考察依據(jù)，以加酶量、pH值、溫度及時(shí)間為考察因素，以蛋白提取率為參考指標(biāo)，設(shè)置酶添加量1.2%、1.4%、1.6%；pH 值為10.5、11、11.5；酶解時(shí)間2.5 h、3.0 h、3.5 h；酶解溫度45 ℃、50 ℃、55 ℃，以正交試驗(yàn)L9（34）為基礎(chǔ)進(jìn)行4因素3水平試驗(yàn)（表2）。

表2 正交試驗(yàn)水平表

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Origin 7.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古櫟橡實(shí)蛋白提取酶的比較

由表3可知，3種蛋白酶酶解橡實(shí)蛋白提取率由高到低分別為堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶。堿性蛋白酶的蛋白酶解率最高達(dá)42.3%，因此選擇堿性蛋白酶為蛋白酶解工藝研究的水解酶。

表3 蒙古櫟橡實(shí)蛋白提取酶的比較

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 加酶量對(duì)橡實(shí)粕蛋白酶提取率的影響

分別向橡實(shí)粕水解液中加入0.2%、0.6%、1.0%、1.4%和1.8%的堿性蛋白酶，將其pH值調(diào)節(jié)到10.0，轉(zhuǎn)移到45 ℃下水解2.5 h 后加熱到90 ℃，滅活堿性蛋白酶15 min。轉(zhuǎn)移至室溫冷卻后，離心取上清液凍干測(cè)定蛋白提取率。如圖1 所示，隨堿性蛋白酶含量的升高，蛋白提取率呈先升高后平緩變化的趨勢(shì)，當(dāng)加酶量為1.4%時(shí)，蛋白提取率達(dá)45.1%。當(dāng)加酶量繼續(xù)升高至1.8%時(shí)并沒有顯著變化。結(jié)合實(shí)際情況并節(jié)約資源，選擇1.4%為堿性蛋白酶的最適添加量。

圖1 加酶量對(duì)橡實(shí)粕蛋白酶提取率的影響

2.2.2 pH值對(duì)橡實(shí)粕蛋白酶提取率的影響

向橡實(shí)粕水解液中加入1.4%的堿性蛋白酶，將其pH 值調(diào)節(jié)到8.0、9.0、10.0、11.0 和12.0，轉(zhuǎn)移到45 ℃下水解2.5 h 后加熱到90 ℃，滅活堿性蛋白酶15 min。轉(zhuǎn)移至室溫冷卻后，離心取上清液凍干測(cè)定蛋白提取率。如圖2 所示，隨pH 值的升高，蛋白提取率呈先升高后平緩變化的趨勢(shì)，在pH 值為11時(shí)達(dá)到最高，蛋白提取率達(dá)47.1%。因此，選擇最適pH值為11。

圖2 pH值對(duì)橡實(shí)粕蛋白酶提取率的影響

2.2.3 時(shí)間對(duì)橡實(shí)粕蛋白酶提取率的影響

向橡實(shí)粕水解液中加入1.4%的堿性蛋白酶，將其pH 值調(diào)節(jié)到10.0，轉(zhuǎn)移到45 ℃下水解1 h、2 h、3 h、4 h和5 h后加熱到90 ℃，滅活堿性蛋白酶15 min。轉(zhuǎn)移至室溫冷卻后，離心取上清液凍干測(cè)定蛋白提取率。如圖3所示，酶解3 h時(shí)蛋白提取率達(dá)到最高48.2%。當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)蛋白提取率變化不明顯。因此，選擇3 h為最適酶解時(shí)間。

2.2.4 溫度對(duì)橡實(shí)粕蛋白酶提取率的影響

向橡實(shí)粕水解液中加入1.4%的堿性蛋白酶，將其pH 值調(diào)節(jié)到10.0 轉(zhuǎn)移到30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃下水解3 h 后加熱到90 ℃，滅活堿性蛋白酶15 min。轉(zhuǎn)移至室溫冷卻后，離心取上清液凍干測(cè)定蛋白提取率。如圖4 所示，溫度為50 ℃時(shí)蛋白提取率達(dá)到最高50.1%。因此，選擇50 ℃為最適酶解溫度。

圖3 時(shí)間對(duì)橡實(shí)粕蛋白酶提取率的影響

圖4 溫度對(duì)橡實(shí)粕蛋白酶提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)

由表4 可知，對(duì)橡實(shí)粕蛋白提取率影響由高到低的因素分別是酶添加量、酶解溫度、pH 值和酶解時(shí)間，最優(yōu)提取條件為酶添加量1.4%，pH值11.5，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間2.5 h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3組平行實(shí)驗(yàn)的提取率均值為56.13%。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

本研究通過酶解法對(duì)橡實(shí)蛋白提取工藝進(jìn)行研究，首先通過比較木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解效果選取適宜的水解酶。選取堿性蛋白酶為水解酶進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以加酶量、pH值、溫度及時(shí)間為考察對(duì)象，分析4種不同因素對(duì)蛋白提取率的影響，確定酶添加量為1.4%，pH 值為11，酶解溫度50 ℃，時(shí)間3 h 時(shí)為適宜的提取條件。以單因素實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果為依據(jù)，進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，得到最佳提取工藝：酶添加量為1.4%，pH 值為11.5，酶解溫度50 ℃，時(shí)間2.5 h，蛋白提取率達(dá)54.6%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3組平行實(shí)驗(yàn)的提取率均值為56.13%，說明該方法所得結(jié)論符合實(shí)際，提取條件適宜。