陳宗耀，李樂樂，王振滔，許世林，李瑤，王艷春，范紅艷△

楊梅黃酮（myricetin）是楊梅樹皮、樹葉、果實(shí)中的主要活性成分，也可來源于藤茶、錦葵科植物及紅提、山楂、葡萄等水果。楊梅黃酮具有抗氧化、降血糖、抗炎、抗腫瘤等生物活性［1］，主要通過影響細(xì)胞增殖、凋亡、癌基因蛋白表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤作用［2］，也可抑制血小板聚集及血小板標(biāo)記蛋白CD41的上調(diào)及PI3K/Akt信號(hào)通路的活化而發(fā)揮抗血栓作用［3］。另有研究顯示，其可通過抗氧化、抗凋亡作用發(fā)揮對急性心肌缺血的保護(hù)作用［4］，通過降低血糖、改善糖原代謝、提高胰島素敏感性、類胰島素作用、抗炎、抗氧化應(yīng)激等發(fā)揮防治糖尿病作用［5］。但是，有關(guān)楊梅黃酮對生殖系統(tǒng)的研究少見。本研究用醋酸鉛建立雄性小鼠的生精障礙模型，旨在觀察楊梅黃酮對鉛染毒雄性小鼠生精功能及激素水平的影響，并探討其作用機(jī)制，為生精障礙的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明雄性小鼠60只，體質(zhì)量23～27 g，月齡1.5個(gè)月，購于吉林大學(xué)生命科學(xué)院，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（吉）2014-0013。

1.2 主要儀器與試劑 電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），顯微鏡（日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社），離心機(jī)（德國艾本德股份公司，型號(hào)5430R），722可見分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）；Model 680型酶標(biāo)儀（美國Biorad公司）。楊梅黃酮（西安萬滋生物科技有限公司，批號(hào)WZ16025，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%），醋酸鉛（上海化學(xué)試劑廠的分析純試劑），甲睪酮（天津力生制藥股份有限公司，批號(hào)1602003）；小鼠睪酮（T）、黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、山梨醇脫氫酶（SDH）酶聯(lián)免疫試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）試劑盒、考馬斯亮藍(lán)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組和造模 昆明種小鼠60只隨機(jī)均分為6組，即對照組、染鉛組、楊梅黃酮低、中、高劑量組（100、200、400 mg/kg）、甲睪酮組（10 mg/kg，即陽性對照組），每組10只。除對照組，各組均腹腔注射醋酸鉛20 mg/kg，連續(xù)7 d，對照組腹腔注射等體積的生理鹽水，自造模2 d開始楊梅黃酮組、甲睪酮組灌胃給藥，連續(xù)42 d，1次/d，楊梅黃酮不溶于水，故選用0.25%羧甲基纖維素鈉溶液為助溶劑，對照組和染鉛組灌胃相同體積的羧甲基纖維素鈉溶液。末次給藥后禁食不禁水24 h，小鼠稱體質(zhì)量后10%水合氯醛（0.3 mL/kg）麻醉，腹主動(dòng)脈取血約0.8 mL，靜置30 min以上，956×g離心15 min，取血清備用。

1.3.2 睪丸指數(shù)測定 斷髓處死后，快速取雙側(cè)睪丸和附睪，剝除脂肪組織及筋膜，迅速稱睪丸質(zhì)量并計(jì)算睪丸指數(shù)（mg/g）=睪丸質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）。

1.3.3 精子密度檢測 取雙側(cè)附睪迅速放于2 mL 37.0℃的生理鹽水培養(yǎng)皿中，用探針將附睪充分剝離開后置于37.0℃恒溫箱中孵育15 min，使精子游出。4層擦鏡紙過濾，得稀釋后的精液。取上述稀釋后的精液100μL，加3%NaCl 100μL混勻后，取10μL滴在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上蓋玻片的邊緣，精液自行滲入，于400倍光學(xué)顯微鏡下按紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算精子密度（1 mL的精子數(shù)=N×5×稀釋倍數(shù)×104；N為5個(gè)中方格精子數(shù)之和，本實(shí)驗(yàn)中稀釋倍數(shù)為2）。對于壓線精子的計(jì)數(shù)原則是數(shù)頭不數(shù)尾，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。每份樣品平行計(jì)數(shù)2次，求平均數(shù)。

1.3.4 精子畸變實(shí)驗(yàn) 取精液1滴于載玻片上涂片?？諝庵懈稍锖螅眉状脊潭? min以上。1%伊紅染色1 h，水輕輕沖掉多余染劑，干燥。置于鏡下統(tǒng)計(jì)畸形精子數(shù)，畸形精子定義為雙頭、雙尾、無鉤、無定形、尾折疊等。為了減少誤差，對同一個(gè)樣品應(yīng)進(jìn)行3次精子計(jì)數(shù)，求其平均數(shù)。

1.3.5 血清中T、LH、FSH含量的測定 取血清，嚴(yán)格按試劑盒說明用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定血清中T、LH、FSH含量。

1.3.6 睪丸組織中SDH活性、MDA含量的測定 取10%睪丸組織勻漿上清液，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，采用ELISA測定睪丸組織中SDH活性；采用硫代巴比妥酸法檢測睪丸組織中MDA含量。取10%睪丸組織勻漿上清液稀釋至1%，檢測睪丸組織蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定。

1.3.7 睪丸HE染色 將睪丸于4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片用于HE染色觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，2組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組睪丸指數(shù)、精子密度及精子畸形率的比較 與對照組比較，染鉛組小鼠睪丸指數(shù)及精子密度降低、精子畸形率增高（P＜0.05）；與染鉛組比較，楊梅黃酮各劑量組、甲睪酮組睪丸指數(shù)及精子密度均升高、精子畸形率下降（P＜0.05），楊梅黃酮各劑量組、甲睪酮組之間睪丸指數(shù)、精子密度及精子畸形率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組血清中T、LH、FSH含量比較 與對照組比較，染鉛組血清中T含量減低，而LH和FSH升高（P＜0.05）；與染鉛組比較，楊梅黃酮各劑量組及甲睪酮組血清中T含量升高、LH、FSH含量均降低（P＜0.05），楊梅黃酮各劑量組、甲睪酮組之間T、LH、FSH含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 各組睪丸組織中SDH活性、MDA含量的比較 與對照組比較，染鉛組小鼠睪丸組織中MDA含量增高、SDH活性降低（P＜0.05）；與染鉛組比較，楊梅黃酮各劑量組及甲睪酮組睪丸組織中MDA含量降低、SDH活性增高（P＜0.05），楊梅黃酮各劑量組、甲睪酮組之間MDA含量、SDH活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.4 小鼠睪丸組織的病理變化 HE染色睪丸組織切片觀察，對照組睪丸生精小管排列緊密，生精細(xì)胞層次和數(shù)量多，生精上皮較厚，生精小管腔可見精子形成；染鉛組與對照組比較，睪丸組織多數(shù)生精小管直徑明顯變細(xì)，間距較寬，生精上皮變薄，生精細(xì)胞層次和數(shù)量均減少，生精小管腔見少量精子形成；楊梅黃酮低劑量組與染鉛組形態(tài)接近，楊梅黃酮中劑量組與染鉛組比較，生精上皮稍增厚，生精細(xì)胞層次和數(shù)量見增多。楊梅黃酮高劑量組及甲睪酮組較染鉛組明顯改善，生精上皮厚，生精細(xì)胞層次和數(shù)量多，生精小管腔內(nèi)見較多精子生成，見圖1。

3 討論

隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅猛發(fā)展，重金屬鉛廣泛并持久存在于人們生活與工作的環(huán)境中，鉛的環(huán)境和職業(yè)暴露已受到全球的廣泛關(guān)注［6］。鉛是聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO/WHO）公布的對人體毒性最強(qiáng)的重金屬（鉛、鎘、汞）之一。國內(nèi)學(xué)者對鉛致我國男性生殖健康影響的Meta分析顯示：鉛可引起陽痿率和早泄率的升高，精子數(shù)量減少，活動(dòng)力下降、畸形率升高［7］。因此，從優(yōu)生優(yōu)育角度考慮，鉛對男（雄）性生殖毒性的研究一直較受重視。利用天然的排鉛產(chǎn)品拮抗鉛的生殖毒性已成為研究的重點(diǎn)，比如苦杏仁苷［8］，苦參總黃酮［9］，橄欖葉［10］等。Dobrakowski等［11-12］研究發(fā)現(xiàn)，鉛的生殖毒性與氧化應(yīng)激損傷關(guān)系密切。

Tab.1 Comparison of testis index,sperm density and sperm deformity rate between six groups表1 6組睪丸指數(shù)、精子密度、精子畸形率比較 ［n=10，M（P25，P75）］

Tab.2 Comparison of serum levels of T,LH and FSH between six groups表2 6組血清中T、LH、FSH含量比較［n=10，M（P25，P75）］

Fig.1 Pathological changes of testicular tissues in six groups of mice(HE staining,×400)圖1 6組小鼠睪丸組織病變情況（HE染色，×400）

Tab.3 Comparison of MDA content and SDH activity of testis tissue between six groups表36組睪丸組織中MDA含量、SDH活性比較

本研究采用腹腔注射醋酸鉛20 mg/kg連續(xù)7 d，構(gòu)建雄性小鼠生精障礙模型。甲睪酮是人工合成的甾體激素，其臨床主要用于治療男性性功能減退等，本實(shí)驗(yàn)選擇甲睪酮作為陽性對照藥。精子質(zhì)量為反應(yīng)雄性生精功能的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究中染鉛組睪丸病理顯示，小鼠睪丸組織明顯損傷，小鼠睪丸指數(shù)、精子密度明顯下降，精子畸形率增高，表明鉛染毒雄性小鼠生精障礙模型建立成功。本研究結(jié)果顯示，給予楊梅黃酮及甲睪酮處理后，小鼠睪丸指數(shù)、精子密度升高，精子畸形率降低，楊梅黃酮中、高劑量組睪丸組織病理與染鉛組比較，生精上皮增厚，生精細(xì)胞層次和數(shù)量明顯增多，表明楊梅黃酮各組及甲睪酮組精子質(zhì)量明顯提高，提示楊梅黃酮具有改善生精功能的作用。

精子的發(fā)生受到下丘腦-垂體-睪丸軸的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，并與睪丸中多種酶的活性密切相關(guān)。下丘腦分泌促性腺激素釋放素（GnRH），GnRH可以刺激垂體分泌FSH和LH，LH刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌T。研究表明，精子質(zhì)量指標(biāo)與其生殖激素水平密切相關(guān)［13］。本研究顯示，染鉛組小鼠血清中T含量下降，LH、FSH含量增高，而楊梅黃酮組及甲睪酮組血清中T含量增高，LH、FSH含量下降，考慮可能原因?yàn)?，鉛損傷睪丸組織，而減少T合成，最終導(dǎo)致精子質(zhì)量下降。同時(shí)T水平不足，會(huì)反饋到下丘腦-垂體-睪丸軸，使得上游激素含量升高。而楊梅黃酮可以改善睪丸功能，使得T合成增加，精子質(zhì)量提高，T合成增加會(huì)負(fù)反饋調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-睪丸軸上游激素，使得LH和FSH含量下降，這與Huhtaniemi等［14］研究一致，提示FSH與LH有協(xié)同作用。綜上，楊梅黃酮作用于睪丸組織，促進(jìn)睪酮分泌，從而改善睪丸的生精功能，而對于下丘腦-垂體-睪丸軸上游激素的具體影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

SDH是糖有氧氧化階段三羧酸循環(huán)過程中的限速酶，參與精子能量代謝，可作為睪丸成熟、精子功能成熟和形態(tài)完善的標(biāo)志酶［15］。相關(guān)研究表明，SDH負(fù)責(zé)為精子細(xì)胞提供能量，將山梨糖醇轉(zhuǎn)化為果糖，SDH的活性與生精細(xì)胞的功能有關(guān)［16］。因此，采用精子特異性酶SDH作為檢測指標(biāo)，結(jié)果可靠。本研究結(jié)果顯示，染鉛組小鼠睪丸組織中SDH活性較對照組下降，而楊梅黃酮組小鼠睪丸組織中SDH活性較染鉛組增高，考慮可能原因?yàn)闂蠲伏S酮可使睪丸組織中SDH活性增高，從而提高精子質(zhì)量，表明楊梅黃酮作用于睪丸組織，提高睪丸及精子活性，從而改善睪丸的生精功能。

MDA是內(nèi)源性脂質(zhì)過氧化的分解產(chǎn)物，臟器組織中MDA含量可表示脂質(zhì)過氧化作用的強(qiáng)弱，MDA含量越高，脂質(zhì)過氧化作用越強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，染鉛組較對照組MDA水平升高，脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，精子質(zhì)量下降；楊梅黃酮組與染鉛組小鼠比較，MDA含量明顯下降，考慮可能原因?yàn)闂蠲伏S酮通過抗氧化作用，對活性氧引起的生殖細(xì)胞氧化損傷有抑制作用，而楊梅黃酮作用于睪丸組織，通過抗氧化作用、減輕醋酸鉛所致睪丸組織氧化應(yīng)激損傷，從而改善睪丸的生精功能。

綜上所述，楊梅黃酮對鉛染毒小鼠的生精功能具有一定保護(hù)作用，機(jī)制可能為楊梅黃酮通過抗氧化作用、減輕醋酸鉛所致睪丸組織氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)睪酮的分泌，提高了睪丸及精子活性，從而改善睪丸的生精功能。楊梅黃酮來源較廣，具有一定的開發(fā)價(jià)值，但有關(guān)楊梅黃酮保護(hù)生精功能的具體細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還需進(jìn)一步探討。