趙鐵軍，宋桂芹，張浩婷，崔偉亮，黃勇，王文棟，張效云△

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一組病因不明、慢性進(jìn)行性肺部疾病，確診后中位生存期為3～5年。肺上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡、成纖維細(xì)胞過(guò)度侵襲引起的肺結(jié)構(gòu)重建是IPF的主要標(biāo)志［1］。目前尚無(wú)特效的抗纖維化藥物，因此尋找IPF治療的有效靶點(diǎn)尤為迫切。有研究報(bào)道輔助性T細(xì)胞17（Th17）是驅(qū)動(dòng)炎癥和肺纖維化最重要的T淋巴細(xì)胞［2］，白細(xì)胞介素-17（IL-17）是Th17分泌的主要細(xì)胞因子，其活性被阻斷后可顯著改善肺纖維化，此作用可能與細(xì)胞凋亡通路有關(guān)［3］。本研究以博來(lái)霉素（bleomycin，BLM）誘導(dǎo)的IFP小鼠為研究對(duì)象，進(jìn)一步探討中和IL-17對(duì)肺組織膠原蛋白和細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響，為肺纖維化的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器 清潔級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠32只，體質(zhì)量（18±2）g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；大鼠抗小鼠IL-17單克隆抗體和同型對(duì)照抗體IgG2a購(gòu)自美國(guó)R＆D systems公司；博來(lái)霉素購(gòu)自海正輝瑞制藥有限公司；Masson染色試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司；抗體Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3購(gòu)自美國(guó)Bioworld生物技術(shù)公司；RNAprep pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、FastQuant RT kit和SuperReal PreMix Plus均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；RM2235切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；顯微照相系統(tǒng)OLYMPUS BX51-cellSensEntry購(gòu)自日本Olympus公司；OmegaLum G化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)aplegen公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型建立 將32只C57BL/6小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型組、中和抗體組和抗體對(duì)照組，每組8只。按照0.01 mL/g體質(zhì)量經(jīng)腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉小鼠，隨后，正常對(duì)照組氣管注入0.1 mL生理鹽水，其余3組均氣管內(nèi)一次性注入等量含BLM的生理鹽水（5 U/kg）。中和抗體組和抗體對(duì)照組在制模3 d后每4 d尾靜脈注射0.2 mL IL-17單克隆抗體（400μg/kg）或同型對(duì)照抗體（400μg/kg），共注射6次，正常對(duì)照組和模型組則給予0.2 mL生理鹽水，飼養(yǎng)28 d統(tǒng)一處死小鼠。

1.2.2 肺組織Masson染色檢測(cè)肺纖維化 取每組小鼠右肺上葉經(jīng)多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋，常規(guī)切片5μm進(jìn)行Masson染色，依據(jù)Wilson等［4］方法在顯微鏡下觀察并評(píng)價(jià)各組肺組織纖維化程度。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)Cleaved-caspase-3和Cleavedcaspase-9蛋白表達(dá) 每組隨機(jī)選取3只小鼠，取左上肺組織準(zhǔn)確稱質(zhì)量100～200 mg，剪成碎塊，加入組織蛋白裂解液（含2%蛋白酶抑制劑），勻漿，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，加一抗4℃孵育過(guò)夜，棄去一抗，TBST漂洗5次，加二抗室溫孵育60 min，棄去二抗，TBST漂洗5次，超敏ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯影，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，用軟件Image J計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)肺組織膠原Ⅰ型和Ⅲ型mRNA表達(dá) 取左下肺組織10～20 mg，加入300μL裂解液，用勻漿器將組織徹底研磨，按照RNAprep pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)膠原Ⅰ型和Ⅲ型mRNA表達(dá)，操作步驟按照FastQuant RT kit和SuperReal PreMix Plus試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸27 s，共40個(gè)循環(huán)。每組8只小鼠，每只設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以GAPDH作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

Tab.1 The primer sequence of gene amplification by fluorescence quantitative PCR表1 熒光定量PCR擴(kuò)增基因引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中和IL-17對(duì)各組肺組織病理學(xué)影響 Masson染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯纖維組織；模型組和抗體對(duì)照組肺泡間隔明顯增寬，可見(jiàn)肺泡塌陷融合，肺纖維化程度嚴(yán)重；中和抗體組的纖維化程度明顯輕于模型組和抗體對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1、2。

Fig.1 Influence of neutralizing IL-17 activity on pulmonary fibrosis score in four groups of mice圖1 中和IL-17對(duì)小鼠肺纖維化評(píng)分的影響

Fig.2 Masson staining of lung tissues in four groups(×400)圖2 4組小鼠肺組織Masson染色（×400）

2.2 中和IL-17對(duì)各組肺組織Cleaved-caspase-3和Cleaved-caspase-9表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，4組間Cleaved-caspase-3和Cleavedcaspase-9表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與正常對(duì)照組相比，模型組Cleaved-caspase-3和Cleaved-caspase-9表達(dá)明顯升高（P＜0.01），采用中和抗體阻斷內(nèi)源性IL-17活性后，Cleaved-caspase-3和Cleavedcaspase-9表達(dá)下降（P＜0.01），抗體對(duì)照組蛋白的表達(dá)與模型組無(wú)差異，見(jiàn)圖3、表2。

Fig.3 Western blot results for Cleaved-caspase-3 and Cleavedcaspase-9 of lung tissues in four groups圖3 4組小鼠肺組織Cleaved-caspase-3和Cleaved-caspase-9 Western blot結(jié)果

Tab.2 Expressions of Cleaved-caspase-3 and Cleavedcaspase-9 proteins detected by Western blot assay表2 Western blot檢測(cè)4組Cleaved-caspase-3和Cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)情況 （n=3，x±s）

2.3 中和IL-17對(duì)各組肺組織膠原Ⅰ型和Ⅲ型mRNA表達(dá)的影響 Real-time PCR結(jié)果顯示，模型組、中和抗體組和抗體對(duì)照組膠原Ⅰ型和Ⅲ型mRNA表達(dá)水平均較正常對(duì)照組高，但中和抗體組膠原Ⅰ型和Ⅲ型mRNA表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

Fig.4 The influence of neutralizing IL-17 activity on collagen typeⅠand typeⅢmRNA in pulmonary tissues in four groups of mice圖4 中和IL-17對(duì)小鼠膠原Ⅰ型和Ⅲ型mRNA表達(dá)的影響

3 討論

3.1 肺纖維化和IL-17的研究現(xiàn)狀 肺纖維化的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，被認(rèn)為與一系列疾病，如放療和化療引起的纖維化、囊性肺病、肉芽腫性肺病、感染或自身免疫性疾病、環(huán)境和吸煙相關(guān)的慢性阻塞性肺病等相關(guān)，也可能沒(méi)有任何潛在的原因。迄今為止，臨床治療措施依然有限，在嚴(yán)重情況下，肺移植是病人的唯一選擇［5］。有研究認(rèn)為肺纖維化的發(fā)生發(fā)展與肺泡上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡、成纖維細(xì)胞異常增殖密切相關(guān)［6］。IL-17是由Th17產(chǎn)生的一種炎癥因子，在BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，IL-17水平在肺、支氣管肺泡灌洗液中顯著升高，IL-17基因敲除小鼠經(jīng)BLM誘導(dǎo)后肺纖維化程度明顯低于野生型小鼠［4］。Mi等［7］發(fā)現(xiàn)IL-17A以依賴轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1的方式促進(jìn)膠原的合成和分泌，并促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

3.2 中和IL-17對(duì)肺組織細(xì)胞Cleaved-caspase-3和Cleaved-caspase-9表達(dá)的影響 線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)的控制中心，不僅通過(guò)氧化磷酸化為機(jī)體提供能量，而且還可以介導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。目前不少研究認(rèn)為線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在IPF發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，會(huì)引起線粒體外膜的滲透性增加及線粒體跨膜電位的下降，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放和凋亡小體的形成，引發(fā)Caspase家族蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程。其中caspase-9是細(xì)胞凋亡的激活劑，激活的caspase-9可以依次激活caspase-3和caspase-7的前體，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；caspase-3是凋亡的執(zhí)行者，激活的caspase-3又可激活caspase-9前體，形成正反饋激活通路，因此檢測(cè)caspase-9和caspase-3的表達(dá)能反映細(xì)胞凋亡的狀態(tài)。本研究免疫印跡結(jié)果顯示，模型組Cleaved-caspase-3和Cleaved-caspase-9表達(dá)明顯升高，說(shuō)明BLM誘導(dǎo)的IPF激活了細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑，中和IL-17使肺組織中Cleavedcaspase-3和Cleaved-caspase-9表達(dá)均低于模型組，但均高于正常對(duì)照組，Cleaved-caspase-3和Cleaved-caspase-9表達(dá)的降低提示中和IL-17導(dǎo)致線粒體凋亡通路活化減弱，細(xì)胞凋亡數(shù)量減少。B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）蛋白家族被認(rèn)為是線粒體凋亡信號(hào)通路中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，以往研究證明，中和IL-17作用后，支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞線粒體凋亡通路上游Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）/Bcl-2表達(dá)降低［8］。本實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步證實(shí)中和IL-17后，線粒體凋亡通路下游Cleaved-caspase-3和Cleavedcaspase-9的表達(dá)也降低，推測(cè)中和IL-17使肺纖維化程度得以改善與細(xì)胞凋亡信號(hào)通路有關(guān)，中和IL-17可能不僅抑制了肺泡上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)了其正常再上皮化，也可能與避免成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞出現(xiàn)過(guò)度增殖和局部持續(xù)的炎性狀態(tài)有關(guān)。此外，中和IL-17還能減輕輻射誘導(dǎo)的肺炎和纖維化，提高小鼠輻射后的存活率，提示IL-17具有促纖維化作用［9］。

IL-17在某些器官又具有抗纖維化功能。最近的一項(xiàng)研究表明，IL-17缺乏與單側(cè)輸尿管梗阻引發(fā)的腎過(guò)度纖維化有關(guān)［10］。醋酸去氧皮質(zhì)酮聯(lián)合血管緊張素所致高血壓的進(jìn)展性腎纖維化模型研究進(jìn)一步證實(shí)了IL-17的抗纖維化作用。在這個(gè)系統(tǒng)中，IL-23/IL-17軸的激活可以保護(hù)腎臟免受纖維化的影響［11-12］。IL-17在某些器官具有促纖維化作用，在某些器官又具有抗纖維化作用，這取決于纖維化所涉及的器官。因此可以針對(duì)這些纖維化相關(guān)疾病制定是否阻斷IL-17信號(hào)的治療方案。

3.3 中和IL-17對(duì)肺組織細(xì)胞膠原mRNA表達(dá)的影響 膠原Ⅰ型、Ⅲ型為肺內(nèi)主要的間質(zhì)型膠原，膠原纖維增生促進(jìn)了肺纖維化的形成。本研究實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，模型組膠原Ⅰ型、Ⅲ型mRNA表達(dá)水平高于正常對(duì)照組和中和抗體組，但中和IL-17處理后兩者mRNA表達(dá)水平明顯下降，其機(jī)制可能與通過(guò)下調(diào)TGF-β1表達(dá)、抑制肌成纖維細(xì)胞的增殖并最終減少膠原的合成有關(guān)。

本文僅針對(duì)肺纖維化模型，未研究中和IL-17對(duì)正常小鼠肺組織膠原和凋亡相關(guān)因子的表達(dá)是否有影響，參考其他學(xué)者的文獻(xiàn)也均未在正常小鼠體內(nèi)做中和IL-17的相關(guān)實(shí)驗(yàn)［8-9］，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，認(rèn)為中和IL-17改善肺纖維化，可能與通過(guò)調(diào)控線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路、降低膠原纖維的形成有關(guān)。肺纖維化是一種復(fù)雜且病因不明的漸進(jìn)性疾病，中和IL-17在肺纖維化疾病中的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討，IL-17有可能成為預(yù)防和治療IPF的新的靶點(diǎn)。