高婧雅，張驪，謝炎，郭慶軍，田大治，李俊杰，蔣文濤△，劉力

絲氨酸-蘇氨酸-酪氨酸激酶1（serine threonine tyrosine kinase 1，STYK1）也稱為NOK，是受體酪氨酸激酶，可選擇性地使酪氨酸殘基磷酸化，其在腫瘤形成與進展的過程中發(fā)揮作用［1-3］。大多數(shù)受體酪氨酸激酶包括胞內(nèi)結構域、跨膜區(qū)和胞外結構域，但是STYK1/NOK的胞外結構域缺乏N端的信號肽。研究表明，STYK1/NOK可誘導裸鼠成瘤和腫瘤轉移，因此認為其為癌基因［4-6］。同時STYK1/NOK在小兒腦膠質(zhì)瘤中高表達，抑制STYK1/NOK表達可降低膽囊癌細胞磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）和蛋白激酶 B（AKT）蛋白表達，抑制細胞增殖和轉移［7］。此外，STYK1/NOK在膽囊癌中也發(fā)揮促進腫瘤增殖的作用［8］。為了探討抑制STYK1/NOK對BHK21細胞的具體影響，筆者進行了轉錄組分析，觀察si-RNA抑制STYK1/NOK后BHK21細胞的基因表達變化及其生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 BHK21細胞購于中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心，用含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基（Hyclone），小牛血清（百奧萊博），轉染試劑Neofect（北京碼因科技有限公司），胰酶（Gibco），One Step TB Green?PrimeScript? RT-PCR KitⅡ 試劑盒（TaKaRa），CCK-8試劑盒（DOJIND公司），β-actin抗體、STYK1/NOK抗體（武漢三鷹），5%CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher），倒置顯微鏡（北京澳浦），熒光定量PCR儀（Biorad Connect）。

1.2 方法

1.2.1 細胞瞬時轉染及鑒定 將BHK21細胞均分為3組，分別轉染6μg空載體pBs/U6（空載體組）、2μg si-STYK1/NOK質(zhì)粒+4μg空載體pBs/U6（低轉染濃度組）和6μg si-STYK1/NOK質(zhì)粒（高轉染濃度組）。消化，傳代BHK21細胞，待第2天細胞長至70%～80%時開始轉染。在轉染前2 h更換培養(yǎng)基。應用半量原則，制作轉染混懸液：3μL轉染試劑+相應質(zhì)粒+150μL無血清培養(yǎng)基，靜置15 min后，逐滴逐部位加入培養(yǎng)皿中。3組細胞瞬時轉染48 h后。消化并提取細胞總蛋白。BCA法定量后將制備好的15μL蛋白樣品行SDS-PAGE（90 V至蛋白跑至分離膠，140 V，2 h）。隨后，300 mA恒流冰浴轉膜2 h。在37℃的振蕩器中，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4℃封閉過夜。次日TBST洗滌后二抗，37℃的振蕩器中孵育1 h。顯影。

1.2.2 轉錄組測序 根據(jù)轉染效果，選取空載體組和高轉染濃度組行轉錄組測序。在轉染48 h后收集細胞，應用Trizol法提取總RNA。檢測RNA質(zhì)量后將每組RNA平均分為2份，置于-20℃保存。檢測RNA質(zhì)量，保證RNA在提取過程中未降解。RNA檢測合格后，構建cDNA文庫。隨后，將雙鏈cDNA進行末端修復、加A尾并連接測序接頭；最后PCR擴增后，使用Illumina HiSeq測序儀進行測序。

1.2.3 測序結果分析 對Illumina HiSeq測序得到的raw data進行過濾，將過濾得到的clean reads比對到參考序列，采用HISAT將clean reads比對到參考基因組［9］?；诒葘Y果，進行差異基因分析，刪選條件為P＜0.001。獲得差異表達基因后，應用R軟件中的pheatmap函數(shù)進行層次聚類分析。多組差異基因同時聚類時，對組間交集差異基因與并集差異基因單獨進行聚類分析。將差異表達基因進行功能分類，應用R軟件中的phyper函數(shù)進行富集分析，對P值進行FDR校正，F(xiàn)DR=0.01的功能視為顯著富集。將差異表達基因進行KEGG信號通路分析，要應用STRING蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org/）中的互作關系進行差異基因蛋白互作網(wǎng)絡的分析（Protein-protein interaction networks，PPI）。

1.2.4 實時定量基因擴增熒光（qRT-PCR）驗證差異表達基因 隨機抽取分析所得的差異表達基因進行qRT-PCR驗證。應用同一批RNA，逆轉錄為cDNA后進行qRT-PCR。反應條件：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。結果采用2ΔΔCt法采用分析，qRT-PCR引物序列見表1。

Tab.1 The primer of qRT-PCR表1qRT-PCR引物

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖 向12孔板的待測孔內(nèi)各加入3×105個細胞，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)約24 h，當細胞匯合度達80%～90%，開始轉染。細胞轉染48 h后胰酶消化，均勻分至96孔板中；置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，待細胞貼壁后，加入5μL CCK-8試劑；再次放入細胞培養(yǎng)箱中，觀察顏色變化，2～2.5 h后用酶標儀測定450 nm處各孔的吸光度。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；應用Graphpad Prism 8.0制作柱形圖，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 si-RNA可抑制BHK21細胞STYK1/NOK蛋白表達 Western blot檢測結果顯示，si-RNA干擾后高轉染濃度組STYK1/NOK表達較低轉染濃度組和空載體組明顯下降，見圖1。

2.2 差異表達基因分析 測序結果顯示，與空載體組相比，高轉染濃度組共有44個差異表達基因，其中表達上調(diào)19個，表達下調(diào)25個（表2）。隨后根據(jù)分析結果，利用差異表達基因制作熱圖（圖2A）和MA圖（圖2B）。

Fig.1 WesternblotdetectionofSTYK1/NOKexpressionsinthreegroups圖1 Western blot檢測3組STYK1/NOK表達

2.3 差異表達基因GO功能和KEGG通路分析 差異表達基因GO功能分析結果分為生物學功能（biological process）、細胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）3部分。44個差異表達基因中，在生物學功能中主要集中在生物調(diào)控（biological regulation）、細胞進程（cellular process）、代謝調(diào)控（metabolic process）、細胞生物過程的調(diào)控（regulation of biological process）等方面；在細胞組分中主要集中在細胞（cell）、細胞部分（cell part）、胞外區(qū)（extracellular region）等方面；在分子功能上主要集中在配體（binding）和催化活性（catalytic activity）上，見圖3A。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要集中作用于免疫系統(tǒng)（Immune system）、癌癥（Cancers:Overview）、信號轉導（Signal transduction）和氨基酸代謝（Amino acid metabolism）等方面，見圖3B。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡分析 根據(jù)差異表達基因制作蛋白互作網(wǎng)絡圖，發(fā)現(xiàn)丙氨酰tRNA合成酶（alanyl tRNA synthetase，AARS）、乙醛脫氫酶18家族成員A1（aldehyde dehydrogenase family18 member A1，Aldh18a1）、磷酸甘油酸脫氫酶（phosphoglycerate dehydrogenase，Phgdh）、亞甲基四氫葉酸脫氫酶1（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1 like，Mthfd1l）、亞甲基四氫葉酸脫氫酶2（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2，Mthfd2）、硫氧還蛋白還原酶1（thioredoxin reductase-1，Txnrd1）和L型氨基酸轉運載體1（L-type amino acid transporter 1，LAT1，又稱Slc7a5）等7個蛋白存在相互作用。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2C（cyclin-Dependent Kinase N2C，Cdkn2c）、細胞周期蛋白 D1（cyclin D1，Ccnd1）、內(nèi)皮素 1（Endothelin1，Edn1）和XP_005077024.1（LOC101839392）等4個蛋白間存在相互作用。此外，結合珠蛋白基因（haptoglobin，Hp）、纖 維 蛋白原 γ鏈（fibrinogen gamma chain，F(xiàn)gg）、纖維蛋白原 α 鏈（fibrinogen alpha chain，F(xiàn)ga）、凝血因子すA 鏈（coagulation factorすA chain，F(xiàn)13a1）的蛋白表達間亦存在相互作用。見圖4。

2.5 qRT-PCR驗證差異表達基因 根據(jù)轉錄組測序結果，選取2個上調(diào)表達基因［Mthfd2、轉錄激活因子5（activating transcription factor 5，Atf5）］和2個下調(diào)表達基因［ⅡA分泌型磷脂酶A2（phospholipase A2 group IIA，Pla2g2a）、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-雙 磷 酸 酶 3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3，Pfkfb3）］行 qRT-PCR

驗證。結果顯示，抑制STYK1/NOK后，Mthfd2、Atf5表達上調(diào)，Pla2g2a、Pfkfb3表達下調(diào)，與測序結果相一致，見表3。

Tab.2 Differentially expressed genes in two groups after knocking down STYK1/NOK expression in BHK21 cells表2 抑制BHK21細胞STYK1/NOK表達后2組差異表達基因

Fig.2 Cluster analysis of differentially expressed genes and differentially expressed MA map in empty vector group and high concentration transfection group圖2 空載體組和高轉染濃度組差異表達基因聚類分析和差異表達MA圖

Fig.3 Functional analysis of differentially expressed genes in empty vector group and high concentration transfection group.圖3 空載體組和高轉染濃度組差異表達基因功能分析

Fig.4 Protein-protein interaction networks of differentially expressed genes in empty vector group and high concentration transfection group圖4 空載體組和高轉染濃度組差異表達基因蛋白互作網(wǎng)絡

2.6 2組細胞增殖情況分析 CCK-8結果顯示，與空載體組相比，高轉染濃度組細胞增殖水平升高，（0.88±0.12 vs.0.41±0.05），差異有統(tǒng)計學意義（n=3，t=6.245，P＜0.01）。

3 討論

許多研究已表明基因表達變異與疾病的發(fā)生發(fā)展相關，如抑制叉頭框K1基因（FOXK1）可抑制肝癌細胞生長［10］，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶16基因（MMP16）表達可促進腎癌生長和侵襲［11］，抑制KCTD10可促進胃腸間質(zhì)瘤轉移與侵襲等［12］。BHK21細胞是倉鼠正常腎細胞，本研究主要探討抑制BHK21細胞中的STYK1/NOK表達對細胞生物功能的影響。通過轉錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，與空載體組相比，抑制STYK1/NOK后共有19個基因表達上調(diào)，25個基因表達下調(diào)，通過GO功能分析和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要位于細胞、細胞部分、胞外區(qū)，參與細胞進程、代謝、細胞生物過程的調(diào)控，主要影響免疫系統(tǒng)、癌癥、細胞周期、信號轉導和氨基酸代謝等方面，其表達上調(diào)基因Mthfd1l［13］、Mthfd2［14］、Ccnd1［15］，表達下調(diào)基因Cdkn2c、Cebpd均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關。

Tab.3 qRT-PCR analysis of differential gene expression in empty vector group and high concentration transfection group表3 qRT-PCR分析空載體組和高轉染濃度組差異基因表達

Mthfd1l是葉酸循環(huán)中的一種酶，主要參與甲酸合成。研究表明Mthfd1l在大腸癌組織中高表達，抑制Mthfd1l表達可抑制大腸癌細胞增殖與侵襲，表明其與大腸癌的發(fā)生發(fā)展相關［13］。Yang等［16］也發(fā)現(xiàn)Mthfd1l在食管鱗狀細胞癌組織中高表達，進一步發(fā)現(xiàn)其在食管癌細胞系TE-1和EC109中亦高表達，抑制其表達可降低TE-1細胞增殖，表明Mthfd1l在食管鱗狀細胞癌中促進腫瘤進展。Eich等［17］發(fā)現(xiàn)Mthfd1l在膀胱癌中高表達，其過表達后促進膀胱癌細胞系增殖與集落形成。

Mthfd2是一種參與葉酸代謝的線粒體酶，位于線粒體內(nèi)，發(fā)揮亞甲基脫氫酶和環(huán)水解酶的雙功能酶。研究發(fā)現(xiàn)Mthfd2在非小細胞肺癌組織及細胞系中高表達，敲低非小細胞肺癌細胞系H1299的Mthfd2表達，可降低細胞周期相關蛋白細胞周期蛋白 A2（cyclin A2，CCNA2）、微小染色體維持蛋白 7（mini-chromosome maintenance protein 7，MCM7）和S期激酶相關蛋白2（S-phase kinase-associated protein2，SKP2）的蛋白和mRNA表達，提示Mthfd2可能通過影響細胞周期促進腫瘤增殖［18］。Lin等［19］研究發(fā)現(xiàn)，Mthfd2過表達與腎癌患者臨床分期及較差預后相關（P＜0.05），敲低腎癌細胞系786-O細胞Mthfd2表達可抑制細胞增殖與侵襲。

Cebpd是CCAAT增強子結合蛋白δ，是涉及細胞分化、代謝、炎癥、生長停滯和細胞死亡等多種生理過程的轉錄因子。Cebpd是候選腫瘤抑制基因，與細胞凋亡及細胞增殖相關。有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中CebpdmRNA表達較正常組織減少，且與肝癌患者預后差相關［20］。此外，ATF5在諸多腫瘤組織，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌中高表達［20-21］。Nukuda等［22］研究表明，通過si-RNA抑制乳腺癌細胞系MCF7的ATF5表達，可降低癌細胞的侵襲性。

本研究中，通過轉錄組測序結果發(fā)現(xiàn)抑制STYK1/NOK表達后BHK21細胞中Mthfd1l、Mthfd2和ATF5高表達，Cebpd低表達。既往認為Mthfd1l、Mthfd2和ATF5高表達均促進腫瘤發(fā)生發(fā)展或是與腫瘤患者較差預后相關，而Cebpd為候選抑癌基因，其低表達亦可能促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，表明抑制BHK21細胞STYK1/NOK蛋白表達后，可能促使BHK21細胞向癌細胞轉化。

綜上所述，BHK21細胞中抑制STYK1/NOK表達后將致使原癌基因表達增強，抑癌基因表達減少，可能導致BHK21細胞癌變。進一步實驗表明，抑制STYK1/NOK蛋白表達后細胞增殖明顯增加，與轉錄組測序結果相符，然而，現(xiàn)有研究表明STYK1/NOK的高表達與諸多腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關，本分析結果與現(xiàn)有文獻報道結果不符，可能是STYK1/NOK在BHK21細胞中具有特殊作用，具體原因仍需進一步研究。