劉毓鋒,曾嘉銳,黃文琪,2,吳振強,*

(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510006;2.江門市泛亞生物工程與健康研究院,廣東江門 529000)

酵素是以果蔬汁等為原料,經(jīng)微生物發(fā)酵釋放或產(chǎn)生更易消化的有機(jī)物質(zhì)的混合發(fā)酵液[1]。果蔬酵素富含SOD酶、乳酸、乙酸及少量乙醇等代謝物和多酚、黃酮等活性物質(zhì),具有抗氧化、防衰老、抑菌、增強免疫、促進(jìn)新陳代謝等生理功能[2-3]。果蔬酵素的發(fā)酵工藝有純種發(fā)酵與自然發(fā)酵,其中純種發(fā)酵需要對果蔬原料進(jìn)行滅菌處理,會造成營養(yǎng)、風(fēng)味的破壞;而自然發(fā)酵是通過原料本身攜帶的酵母菌等微生物進(jìn)行發(fā)酵,未對原料本身進(jìn)行高溫滅菌處理,能有效保留原料中本身具有的活性物質(zhì),發(fā)酵微生物主要有酵母菌、乳酸菌等益生菌及曲霉[4]。傳統(tǒng)生產(chǎn)酵素多偏向于采用自然發(fā)酵工藝進(jìn)行[5]。如張夢梅等[6]研究表明不同原料果蔬酵素自然發(fā)酵過程中廣泛存在酵母菌與乳酸菌;陳英等[7]報道果蔬酵素發(fā)酵過程中酵母菌、乳酸菌互利共生,促進(jìn)轉(zhuǎn)化生成酯類、酸類等,賦予發(fā)酵產(chǎn)品獨特的風(fēng)味及口感。酵素自然發(fā)酵的研究熱點多集中在提高抗氧化性能等功能作用[8-9]。其中,郭艷萍等[10]研究表明葡萄酵素自然發(fā)酵可使其抗氧化能力提高;劉維兵等[11]發(fā)酵葡萄海棠果酵素,表明酵素產(chǎn)品具有一定的抑菌性和抗氧化活性。酵素產(chǎn)品添加外源碳源發(fā)酵,可提高發(fā)酵產(chǎn)品的營養(yǎng)價值及功效作用。如蔣增良等[12]按葡萄與紅糖質(zhì)量比1∶1自然發(fā)酵釀制葡萄酵素,發(fā)酵后總酸含量、抗氧化能力提高,有機(jī)酸以酒石酸、乙酸、檸檬酸為主,較強的自由基清除能力與有機(jī)酸、多酚、SOD酶等相關(guān);楊小幸等[5]按蘋果與白糖質(zhì)量比2∶1自然發(fā)酵,發(fā)酵后乳酸、乙酸等有機(jī)酸含量提高;洪厚勝等[13]添加糖蜜制備葡萄果渣酵素,表明酵母菌在厭氧條件下產(chǎn)生乙醇,乳酸菌代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸,豐富了有機(jī)酸種類;張艷明等[14]釀制葡萄牛蒡酵素,結(jié)果表明添加30%白糖糖化牛蒡,使酵素口感更為醇厚;李騰宇等[15]以紅糖為原料釀造紅糖醋,發(fā)酵后乙酸含量增加,多酚、黃酮含量與抗氧化能力正相關(guān);張旭普等[16-17]添加蜂蜜進(jìn)行糙米酵素發(fā)酵,經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后酵素口感及營養(yǎng)價值得到改善。近來,因紅糖相比其它精制糖,更富含礦物質(zhì)及維生素、有機(jī)酸等營養(yǎng)物質(zhì),其消費熱度逐漸提高并廣泛用于食品及飲料加工等方面[18-19]。

多數(shù)酵素產(chǎn)品添加較高濃度的外源碳源進(jìn)行發(fā)酵,但在外源碳源對微生物生長代謝的相關(guān)報道較少,主要功效及功能成分缺乏對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn),使國內(nèi)果蔬發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量難于評判[20]。本文以葡萄為原料,添加外源碳源,包括紅糖、白糖或蜂蜜等進(jìn)行自然發(fā)酵,探究發(fā)酵過程中酵母菌和乳酸菌生長,以及SOD酶活、總酸含量、有機(jī)酸、pH、抗氧化活性等理化特性的變化趨勢,尋找適于葡萄酵素釀制的外源碳源,為天然酵素產(chǎn)品的綜合開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

夏黑葡萄(新鮮,無腐爛,無霉變,大小、重量均勻) 市售;紅糖 廣州太古糖業(yè)有限公司;白糖(白砂糖) 廣州福正東海食品有限公司;蜂蜜 上海冠生園(集團(tuán))有限公司;有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) 上海源葉生物科技有限公司;果膠酶(10000 U/g) 南寧東恒華道生物科技有限公司;磷酸(色譜純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;甲醇(色譜純) 北京邁瑞達(dá)科技有限公司;DPPH(≥99%)、ABTS(≥99%) 美國Sigma-Aldrich公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

JYL-C022E榨汁機(jī) 濟(jì)南九陽股份有限公司;MP502B電子天平 上海精密實驗器材有限公司;SW-CK-1F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;LRH-150B生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司;PB-10型pH計 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;LB62T折光儀 廣州速為電子科技有限公司;SpectraMax自動酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司;HC-2066高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;Waters2695高效液相色譜儀、HPLC二極管陣列檢測器2998 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄酵素發(fā)酵 挑選新鮮、無腐爛、無霉變的葡萄,用榨汁機(jī)打碎,全部操作在無菌操作臺內(nèi)進(jìn)行;加入0.1 g/L果膠酶,酶解溫度40 ℃,酶解時間30 min。紅糖、白糖、蜂蜜用紫外殺菌1 h,按果汁∶碳源=100∶60 g/g的比例在果汁中分別添加紅糖、白糖、蜂蜜,對照組未添加外源碳源,同時測定培養(yǎng)基中固形物含量和還原糖含量,并于厭氧條件下室溫靜置發(fā)酵15 d,每3 d取樣檢測[9-10]。

1.2.2 微生物指標(biāo)測定 酵母菌總數(shù)、乳酸菌(嗜熱鏈球菌、乳桿菌)總數(shù):分別參照GB 4789.15-2016[21]、GB 4789.35-2016[22],根據(jù)菌落形態(tài)計數(shù)[6]。

1.2.3 理化指標(biāo)測定 乙醇含量、pH、總酸、可溶性固形物含量及還原糖測定方法,詳見表1所示。其中,可溶性固形物含量及還原糖含量是在發(fā)酵前檢測,而乙醇含量、pH及總酸含量是在發(fā)酵的不同時間取樣檢測。

表1 理化指標(biāo)測定

1.2.4 有機(jī)酸含量測定 參照Zotou等[23]法適當(dāng)改進(jìn):取10 mL酵素樣品于容量瓶中,定容至100 mL。C18固相萃取小柱用10 mL甲醇、10 mL水活化,將上述稀釋后酵素樣品過柱除去色素等雜質(zhì),棄去前6 mL流出液,收集后段流出液,使用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行液相分析。色譜條件:色譜柱ODS-C18(4.6×250 mm,5 μm);流動相為97%磷酸二氫鉀溶液(0.05 mol/L,用磷酸將pH調(diào)至2.5):3%甲醇;洗脫程序為等梯度洗脫;流速0.6 mL/min;檢測波長210 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣10 μL。各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線如表2所示。

表2 5種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸分析

1.2.5 SOD酶活測定 參照GB/T 5009.171-2003[24],采用Marklund方法。

1.2.6 抗氧化活性測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力測定 參照Sadabady等[25]法,稍作修改。取50 μL稀釋至1%濃度的樣液于試管中,加入400 μL 1×10-4mol/L DPPH甲醇溶液,混勻后避光反應(yīng)30 min。在波長517 nm下測定吸光值,對照溶液吸光值記為A0,樣品溶液吸光值記為A1,樣液本底吸光值記為A2,由公式1換算得自由基清除率,結(jié)果代入VC標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=2.06x-6.681,R2=0.994),以VC當(dāng)量含量(mg VC/L)表示。

DPPH自由基清除率(%)=(1-(A1-A2)/A0)×100

式(1)

1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力測定 參照Tai等[26]法,稍作修改。配置ABTS+自由基溶液:取等體積2.45×10-3mol/L K2S2O8與7×10-3mol/L ABTS+混合,25 ℃避光反應(yīng)16 h后,用乙醇稀釋至734 nm下吸光值0.70±0.02,待用。取50 μL稀釋至1%濃度的樣液于試管中,加入400 μL ABTS+溶液,混勻后避光反應(yīng)10 min。在波長734 nm下測定吸光值,對照溶液吸光值記為A0,樣品溶液吸光值記為A1,樣液本底吸光值記為A2,由公式2換算得自由基清除率,結(jié)果代入VC標(biāo)曲(y=2.018x-1.423,R2=0.991),以VC當(dāng)量含量(mg VC/L)表示。

ABTS+自由基清除率(%)=(1-(A1-A2)/A0)×100

式(2)

1.2.6.3 OH自由基清除能力測定 參照Liu等[27]所述方法,取100 μL稀釋至1%濃度的樣液于試管中,加入100 μL 6×10-3mol/L FeSO4溶液和100 μL 2.4×10-3mol/L H2O2溶液,25 ℃避光反應(yīng)10 min后,加入100 μL 6×10-3mol/L水楊酸溶液,30 ℃條件下反應(yīng)30 min。在波長510 nm下測定吸光值,對照溶液吸光值記為A0,樣品溶液吸光值記為A1,樣液本底吸光值記為A2,由公式3換算得OH自由基清除率,結(jié)果代入VC標(biāo)曲(y=0.404x+3.01,R2=0.99),以VC當(dāng)量含量(mg VC/L)表示。

OH自由基清除率(%)=(1-(A1-A2)/A0)×100

式(3)

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄酵素培養(yǎng)基固形物及還原糖含量測定結(jié)果

表3中,對照組未添加碳源,可溶性固形物含量及還原糖含量顯著低于添加碳源組(P<0.05)。添加碳源組中,紅糖、白糖組的可溶性固形物含量及還原糖含量差異不顯著(P>0.05),可能是紅糖與白糖主要由蔗糖等成分組成[18-19];蜂蜜組還原糖含量顯著高于紅糖、白糖組(P<0.05),這與Lee等[28]報道蜂蜜富含葡萄糖、果糖等還原糖一致。

表3 葡萄酵素培養(yǎng)基固形物及還原糖含量

2.2 外源碳源對酵母及乳酸菌生長的影響

水果酵素天然發(fā)酵的微生物以酵母為主,同時也含有部分乳酸菌[6]。添加碳源對微生物生長影響如圖1所示。

圖1 添加碳源對微生物生長的影響

圖1A顯示,對照組因未添加碳源,具有低滲透壓環(huán)境,發(fā)酵初始(0～3 d)酵母菌利用果汁具有的還原糖迅速生長,在3 d達(dá)峰值2.5×107CFU/mL,隨后下降,果汁中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗導(dǎo)致無法繼續(xù)滿足其生長需求,酵母菌進(jìn)入衰亡期,菌體自溶,菌數(shù)在第6 d接近0;同時從圖1B看出,乳酸菌未檢出,推測是競爭性生長中酵母菌占絕對優(yōu)勢,其快速生長及乙醇代謝遏制了乳酸菌繁殖[29]。

在添加碳源的各組中,初始糖質(zhì)量濃度高于11 g/100 mL(表3)，使微生物生長初始受抑制[5,30],圖1A表明對酵母菌生長抑制作用由小到大依次為:蜂蜜、紅糖、白糖。其中,添加蜂蜜組的酵母菌數(shù)量增長速度及最大細(xì)胞濃度(第9 d峰值達(dá)1.355×107CFU/mL)顯著高于紅糖、白糖組(P<0.05)。結(jié)合表3可知蜂蜜中的還原糖含量最高(P<0.05),而蜂蜜主要由葡萄糖、果糖等多種單糖組成,因此滿足于酵母菌生長的營養(yǎng)需求,使酵母菌快速且持續(xù)更長時間生長[28]。相反,乳酸菌的生長以添加紅糖的效果為佳,其增長速度及最大細(xì)胞濃度均大于其它組(P<0.05),在第6 d達(dá)到峰值7.05×106CFU/mL(圖1B),這可能由于紅糖中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子,包括礦物質(zhì)、維生素、必需氨基酸等[31]。添加碳源組酵母菌、乳酸菌數(shù)量達(dá)到峰值后均下降,原因一是營養(yǎng)物質(zhì)逐漸耗盡,二是代謝物的抑制,包括乳酸菌代謝產(chǎn)生的苯乳酸、環(huán)肽等抑制酵母生長,而乳酸菌生長受酵母乙醇代謝及產(chǎn)生的脂肪酸抑制[32],但它們的共生機(jī)理尚未清楚[33]。

2.3 外源碳源對微生物代謝的影響

2.3.1 乙醇代謝 發(fā)酵過程中各組乙醇含量呈上升趨勢,直至發(fā)酵結(jié)束,乙醇主要是由酵母菌糖代謝所生成[34]。發(fā)酵初期(3 d),對照組乙醇含量顯著高于添加碳源組(P<0.05),達(dá)4.3%vol,這是由于其低滲透壓環(huán)境利于酵母菌快速生長(圖1A)及進(jìn)行乙醇代謝;添加碳源的各組在6～12 d乙醇含量提高幅度較大,12～15 d期間變化較小(表4),對乙醇代謝抑制能力由大到小依次為白糖>紅糖>蜂蜜,其中蜂蜜組發(fā)酵后乙醇含量高達(dá)4.74%vol,而白糖組僅為1.62%vol,這與前面酵母菌生長的結(jié)果一致(圖1B)。結(jié)果表明傳統(tǒng)酵素釀制添加較高濃度碳源,可減緩酵母菌生長和乙醇代謝速率,并以白糖、紅糖添加為佳;楊小幸等[5]報道以白糖為外源碳源進(jìn)行蘋果酵素自然發(fā)酵,前14 d未檢測出乙醇,在第21 d乙醇含量達(dá)3.45%±0.92%vol,與本試驗添加碳源顯示相同的規(guī)律,但不同水果原料攜帶菌種不同,水果原料的營養(yǎng)物質(zhì)也不同,導(dǎo)致自然發(fā)酵中乙醇代謝能力存在差異。

表4 添加不同碳源下的乙醇代謝

2.3.2 總酸代謝與pH變化 總酸含量變化是衡量酵素發(fā)酵成熟度的標(biāo)識之一,為酵素的主要理化指標(biāo)[35]。各組發(fā)酵過程中pH和總酸含量變化如圖2所示。

由圖2可知,對照組發(fā)酵后pH上升,總酸含量減少,與添加碳源組呈相反規(guī)律,可能對照組糖含量較低,酵母菌利用有機(jī)酸為碳源進(jìn)行生長代謝。紅糖、白糖、蜂蜜組pH變化差異顯著(P<0.05),在12 d內(nèi)分別由初始值4.16、3.82、3.90降至3.83、3.54、3.64,后趨于平緩。對應(yīng)的總酸含量在12 d內(nèi)也呈上升趨勢,紅糖、白糖、蜂蜜組總酸含量分別由初值1.02%、0.71%、0.8%升至1.17%、0.8%、0.91%,然后趨于平緩,這與發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量增加有關(guān)[35],其中紅糖組pH及總酸含量變化均大于其它組,這與前面乳酸菌變化規(guī)律(圖1B)一致。結(jié)果表明添加紅糖促進(jìn)乳酸菌生長及產(chǎn)酸代謝,致使pH下降及總酸含量增大。蔣增良等[9]報道葡萄酵素添加紅糖自然發(fā)酵中pH在前8 d變低,之后趨于平緩,與本結(jié)果相似。

圖2 不同碳源下的發(fā)酵液pH(A)及總酸(B)變化

2.3.3 有機(jī)酸代謝 葡萄原料的有機(jī)酸以酒石酸、蘋果酸為主[36]。發(fā)酵前后碳源對有機(jī)酸代謝影響如表5所示。

表5 碳源對有機(jī)酸代謝影響

由表5可知,發(fā)酵初始,較于對照組,添加不同碳源對培養(yǎng)基的有機(jī)酸含量影響較大,其中紅糖組的含量顯著高于白糖、蜂蜜組,特別是乳酸和乙酸含量,在其它組中檢測不出,這表明紅糖給葡萄培養(yǎng)基帶入了多種類型有機(jī)酸(表5)。發(fā)酵15 d后,對照組的酒石酸、蘋果酸含量減少,可能是酵母菌以有機(jī)酸為碳源進(jìn)行代謝活動。而添加碳源的各組,除了酒石酸含量出現(xiàn)下降外,其它有機(jī)酸含量均呈上升趨勢;其中白糖、蜂蜜組酒石酸含量輕微減少,而紅糖組酒石酸含量顯著減少(P<0.05),這是由于紅糖組較其它組存在較多乳酸菌,而乳酸菌能將酒石酸降解成乳酸、乙酸,使發(fā)酵后乳酸及乙酸含量提高[37]。同時,發(fā)酵后蘋果酸含量提高,可能是發(fā)酵體系中果膠酶對果肉作用,使得果肉中的有機(jī)酸等不斷浸出引起[38]。有研究認(rèn)為是蘋果酸被乳酸菌分解會導(dǎo)致含量減少[39],與本結(jié)果不一致,原因可能是本實驗果膠酶對果肉中蘋果酸的浸出量大于其被乳酸菌分解的量。

此外,各組檸檬酸含量發(fā)酵后均顯著增加(P<0.05),這可能是微生物通過三羧酸循環(huán)所合成,致使其含量增加,這與張婷等[40]考察木薯釀制過程中有機(jī)酸變化結(jié)果一致。

2.4 添加碳源對生物活性影響

圖3 不同碳源下發(fā)酵液SOD酶活的變化

由圖3可知,葡萄酵素發(fā)酵后SOD酶活均有提高,其中紅糖組顯著高于其它組(P<0.05),第9 d時SOD酶活達(dá)最大值91.05 U/mL。莫大美等[42]利用酵母及乳酸菌發(fā)酵制備玫瑰酵素,發(fā)酵9 d時產(chǎn)品SOD酶活性最高,與本實驗結(jié)果一致。SOD酶活提高原因是,發(fā)酵過程益生菌代謝活動分泌出SOD酶等生物活性物質(zhì)[43],表現(xiàn)出更強的自由基清除能力。

發(fā)酵后期各組SOD酶活有所下降趨勢,原因是pH改變導(dǎo)致SOD酶活變化[44]。同時,隨著發(fā)酵時間的延長,一些活性物質(zhì)如VC、VE及多酚等被氧化破壞[45],使酵素自由基清除條件變差,SOD酶活表現(xiàn)下降趨勢。

2.4.2 DPPH自由基清除能力 添加碳源可促進(jìn)益生菌代謝產(chǎn)生SOD酶、有機(jī)酸等活性物質(zhì),因此發(fā)酵后自由基清除能力得以提高。IC50作為評定物質(zhì)抗氧化能力常用的參數(shù),指50%自由基清除率對應(yīng)的樣品濃度[46],該值越小,表示樣品抗氧化性越強。具體由圖4所示。

圖4 不同碳源下DPPH自由基清除能力(A)及IC50(B)變化

由圖4A可知,各實驗組發(fā)酵后DPPH自由基清除率均顯著增大(P<0.05),其中紅糖組對DPPH自由基清除能力最大,為25.79 mg VC/L,較發(fā)酵前提高了32.53%。發(fā)酵后,各組IC50值由大到小依次為對照組>白糖組>蜂蜜組>紅糖組(圖4B),即抗氧化能力大小依次為紅糖組、蜂蜜組、白糖組、對照組,這與總酸、SOD酶活(圖2B、圖3)呈正相關(guān),而有機(jī)酸、SOD酶具有清除自由基的能力[12,43]。對DPPH自由基清除能力最大為紅糖組,結(jié)果表明添加紅糖發(fā)酵具有更強抗氧化性。

2.4.3 ABTS+自由基清除能力 圖5A中,各組發(fā)酵后ABTS+自由基清除率均顯著提高(P<0.05),與DPPH自由基清除率一致。發(fā)酵后,紅糖、白糖、蜂蜜及對照組ABTS+自由基清除率分別為37.12、16.15、18.77和13.54 mg VC/L,結(jié)合圖5B中發(fā)酵后紅糖組IC50值(0.72%)最低,表明酵素添加紅糖對ABTS+自由基有更強的清除作用。結(jié)合圖4知,紅糖組對ABTS+自由基能力(37.12 mg VC/L)大于DPPH自由基清除能力(25.79 mg VC/L),這與蔣增良等[9]添加紅糖釀造葡萄酵素時,ABTS+自由基清除率增幅大于DPPH自由基清除率的結(jié)果一致,這可能是因為ABTS+自由基能與更廣泛的抗氧化物質(zhì)反應(yīng)[47]。

圖5 不同碳源下ABTS+自由基清除能力(A)及IC50(B)變化

2.4.4 OH自由基清除能力 由圖6A可知,發(fā)酵初始添加碳源組對OH自由基清除能力均與對照組相當(dāng),說明外源碳源具有的活性物質(zhì)對OH自由基清除作用不大,但發(fā)酵后紅糖組的OH自由基清除率顯著高于白糖和對照組(P<0.05),原因可能是紅糖促進(jìn)微生物產(chǎn)生SOD酶、有機(jī)酸等多種活性物質(zhì),使發(fā)酵后抗氧化活性更高[12,43]。

圖6 不同碳源下OH自由基清除能力(A)及IC50(B)變化

較DPPH、ABTS+自由基清除率,葡萄酵素對OH自由基清除作用更為高效,其中1%濃度紅糖組(發(fā)酵15 d)達(dá)148.23 mg VC/L,這與蔣增良等[12]報道葡萄酵素對羥基自由基具有極高清除活性一致,同時表明添加紅糖作為外源碳源,可使發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化能力增大。

3 結(jié)論

葡萄酵素補充合適的碳源自然發(fā)酵可減緩酵母菌生長及乙醇代謝,同時促進(jìn)乳酸菌的生長,避免了造成乙醇含量偏高,并代謝更多有機(jī)酸等活性物質(zhì),但不同碳源產(chǎn)生的影響不同,其中,添加白糖發(fā)酵15 d乙醇含量為1.62%vol,顯著低于紅糖與蜂蜜碳源,僅為對照組的24.00%。實驗組總酸在發(fā)酵周期內(nèi)呈先上升后趨于平緩趨勢,與對照組單邊下降趨于平緩的趨勢相反。添加碳源后葡萄酵素發(fā)酵提升蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸等有機(jī)酸含量,但會降低酒石酸含量。添加碳源發(fā)酵可提高葡萄酵素的活性,其中添加紅糖獲得的SOD酶活明顯高于其它實驗組和對照組,達(dá)到91.05 U/mL;抗氧化活性(DPPH、ABTS+、OH自由基清除能力)具有相同結(jié)果,分別為25.79、37.12、148.23 mg VC/L。優(yōu)化添加碳源進(jìn)行葡萄酵素發(fā)酵,可提升發(fā)酵產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。