鄒 婷 胡國恒 劉 侃 王瑾茜 王小菊

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

缺血性中風（CIS），又稱缺血性腦卒中、腦梗死，屬于中醫(yī)學“中風”范疇，是指各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應障礙，導致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進而產(chǎn)生神經(jīng)功能缺損，出現(xiàn)相應的臨床表現(xiàn)［1］。中風具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點［2］。溶栓有嚴格治療時間窗的限制、諸多禁忌證，且有易引起顱內(nèi)出血的風險［3］，而對癥、保守治療效果欠佳。大量研究證實了間充質(zhì)干細胞能用來進行移植治療腦損傷，有一定療效且安全［4］；前期研究表明［5-6］腎腦復元湯治療缺血性中風不僅能降低卒中后致殘率、死亡率，促進神經(jīng)功能的修復，并對運動、感覺及語言等多項神經(jīng)功能損傷的恢復有明顯的修復作用。本研究擬制備局灶性腦缺血（MCAO）大鼠模型，觀察腎腦復元湯和hUC-MSCs移植對模型大鼠缺血側(cè)腦組織肝細胞生長因子（HGF）蛋白表達水平的影響，為缺血性腦卒中的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（300±10）g，均由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)［許可證號SYXK（湘）2009-0001］，購于湖南省斯萊克景達動物實驗有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號SYXK（湘）2011-0003］。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境保持清潔、通風、恒溫，定期更換墊料，消毒籠具，常規(guī)條件飼養(yǎng)，1周后造模。

1.2 人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

正常健康順產(chǎn)嬰兒臍帶組織，來自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，已與產(chǎn)婦簽署知情同意書，實驗已獲醫(yī)院倫理委員會批準。組織塊法培養(yǎng)hUC-MSCs；流式細胞儀對其鑒定［9］，按照間充質(zhì)干細胞的鑒定標準（國際細胞療法協(xié)會），要求CD73、CD105、CD90、CD29陽性表達率超過95%，CD45、CD34、CD14、CD79a/CD19和HLA-DR的表達率低于2%；臺盼藍染色檢測細胞活率超過85%。參照Li等［10-11］的方法，將培養(yǎng)細胞鑒定具備分化成脂、成骨的能力。

1.3 試藥與儀器

腎腦復元湯：熟地黃10 g，山藥15 g，山茱萸肉10 g，黃芪30 g，牡丹皮10 g，紅景天20 g，當歸尾10 g，地龍10 g，赤芍10 g。藥材經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科鑒定為道地藥材，水煎濃縮至含生藥2 g/mL，放置冰箱（4℃）冷藏備用。HGF抗體來自武漢BOSTER公司。主要試劑：兔抗大鼠HGF試劑盒（武漢博士德生物公司）；通用pv9000試劑盒（上海瑞齊生物科技有限公司）；水合氯醛（武漢市法迪斯公司）。主要儀器：精密電子天平（OHAUS），石蠟切片機（Reicher-thisto STAT），光學顯微鏡（Olympus），電子體溫計。

1.4 分組與造模

大鼠隨機分為5組：假手術(shù)組、模型組、中藥組、干細胞組、聯(lián)合組，假手術(shù)組只分離血管不插入線栓，其余各組均予右側(cè)MCAO造模。造模前禁食24 h，術(shù)前稱質(zhì)量，腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.350 g/kg）麻醉并保溫，建立大鼠大腦中動脈內(nèi)栓線阻斷方法［7］，必要時適當改進。缺血時間達到2 h后，拔除線栓即形成再灌注。再灌注2 h后按照Zea Longa法［8］的方法，1～3分納入標本。

1.5 給藥方法

各組于造模后24 h開始給藥，聯(lián)合組和干細胞組大鼠局灶性腦缺血2 h再灌注1 d后，經(jīng)尾靜脈注入1×106hUC-MSCs，模型組經(jīng)尾靜脈注入等體積蒸餾水。模型組及干細胞組分別灌胃等體積蒸餾水（10 mL/kg），聯(lián)合組灌胃等體積腎腦復元湯。灌胃每日1次，直至處死。各組按處死時間點再隨機分為給藥后3、7、14 d 3個亞組，每個亞組保證有5只完成實驗。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 神經(jīng)功能缺損嚴重程度評分量表（m-NSS）評分 各組分別在造模成功后3、14 d處死前1 h采用改良大鼠m-NSS［10］，對大鼠各項生理功能（運動、感覺功能、平衡能力及生理反射）進行等級評分，正常記0分，異常者根據(jù)量表及嚴重程度記1～6分，總分為18分，無法完成以上某項測驗則計1分。1～6分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為重度損傷。

1.6.2 腦組織HE染色 采用大鼠腹腔深麻醉（10%水合氯醛0.4 mL/100 g）的方式，將4%多聚甲醛緩沖液約300～400 mL灌注上肢及頭腦，剔除顱骨取腦后，將腦冠狀切開（視交叉平面前后2 mm），留取中間部分置入4%多聚甲醛內(nèi)4℃下固定6 h，然后常規(guī)進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明后石蠟包埋，保存?zhèn)溆?。蠟塊連續(xù)切片，厚5 μm，每隔5片取1張備用。

1.6.3 HGF檢測 采用Western blotting檢測腦組織中HGF蛋白的表達情況，以GAPDH為內(nèi)參，采用IPP6.0軟件對條帶進行圖像分析，以HGF產(chǎn)物與GAPDH產(chǎn)物條帶灰度值的比值（即相對灰度值）作為HGF蛋白表達的指標，相對灰度值越高，說明HGF蛋白表達程度越高。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損評分比較

見表1。假手術(shù)組未見明顯神經(jīng)功能缺損癥狀。3 d后中藥組與干細胞組、聯(lián)合組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；7 d后模型組與中藥組、干細胞組、聯(lián)合組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），聯(lián)合組與中藥組、干細胞組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05）；14 d后模型組與中藥組、干細胞組、聯(lián)合組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），聯(lián)合組與中藥組、干細胞組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。隨著用藥時間延長神經(jīng)功能評分逐漸減少，說明腎腦復元湯及hUC-MSCs移植對大鼠缺血性腦損傷均有一定的保護作用，具有促進神經(jīng)功能恢復的功能。

表1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損評分比較（分，±s）

與模型組同時間比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與聯(lián)合組同時間比較，○P＜0.05，○○P＜0.01；與干細胞組同時間比較，◆P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組中藥組干細胞組聯(lián)合組n 5 5 5 5 5術(shù)后1 d 0.00±0.00**11.2±0.86 11.40±1.03 11.80±1.07 11.20±0.58術(shù)后3 d 0.00±0.00**9.40±0.75 9.00±0.71◆○7.20±0.66*6.80±0.58**術(shù)后7 d 0.00±0.00**8.00±0.71**5.80±0.66**○○5.60±0.51**○3.60±0.51**術(shù)后14 d 0.00±0.00**5.60±0.68 3.40±0.51**○3.80±0.37**○○1.80±0.37**

2.2 各組梗死區(qū)神經(jīng)細胞觀察

見圖1。腦組織切片行HE染色后，高倍鏡下（200倍）神經(jīng)元細胞胞質(zhì)呈桃紅色，細胞核為藍紫色。假手術(shù)組各時間點大鼠CA1區(qū)及DG區(qū)見神經(jīng)細胞大小、形態(tài)正常，細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞排列整齊，細胞核大而圓，且居中，核仁清晰無異常表現(xiàn)。聯(lián)合組3個時間點CA1區(qū)和DG區(qū)神經(jīng)元與假手術(shù)組神經(jīng)細胞大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)、排列等相似，且隨著用藥時間的延長與假手術(shù)組的神經(jīng)元相似度越接近，僅見少量神經(jīng)細胞核變性。

圖1 聯(lián)合組不同時間點腦梗死區(qū)神經(jīng)細胞（HE染色，200倍）

2.3 各組腦組織HGF表達比較

見圖2，表2。MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織HGF的表達在假手術(shù)組均無明顯變化，而在其余各組3、7、14 d HGF的表達均有不同程度增高，但聯(lián)合組表達最為明顯；術(shù)后3 d，與模型組比較，中藥組無明顯變化（P＞0.05），干細胞組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但聯(lián)合組較各組均高（P＜0.01）；術(shù)后7、14 d，中藥組、干細胞組、聯(lián)合組HGF表達均增高，說明腎腦復原湯及hUCMSCs均可促進HGF蛋白的表達，但中藥組與干細胞組無明顯差異（P＞0.05），聯(lián)合組較中藥組、干細胞組HGF表達均增高（P＜0.01），說明二者聯(lián)合效果更佳。

表2 各組大鼠不同時間點缺血側(cè)腦組織內(nèi)HGF表達比較（相對灰度值，±s）

表2 各組大鼠不同時間點缺血側(cè)腦組織內(nèi)HGF表達比較（相對灰度值，±s）

組別假手術(shù)組模型組中藥組干細胞組聯(lián)合組n5 5 5 5 5 3 d 0.076±0.23*0.093±0.01 0.094±0.12○○0.096±0.03*○○0.212±0.52**7 d 0.076±0.12*0.180±0.31 0.185±0.43*○○0.186±0.80*○○0.386±0.15*14 d 0.079±0.13 0.328±0.51 0.550±0.05*○○0.538±0.84*○○0.779±0.26*

圖2 各組腦組織中HGF蛋白的表達

3 討論

HGF最初是于20世紀80年代由肝切除的大鼠血漿中分離提純獲得，并對肝損傷后再生起重要作用［12］。原位雜交、免疫組化等研究表明，HGF不僅在神經(jīng)元細胞中有表達，且在非神經(jīng)元細胞，如室管膜、脈絡(luò)叢和松果體等處也有較高水平的表達。近年研究發(fā)現(xiàn)HGF具有多種生物學特性，通過與c-met受體結(jié)合，不僅可促進細胞有絲分裂、遷移運動和形態(tài)發(fā)生，而且還在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和形態(tài)維持中具有重要作用；另外，HGF還可通過與其受體結(jié)合直接作用于內(nèi)皮細胞而起到生血管作用。研究表明在缺血損傷的組織中，HGF分泌增多、受體上調(diào)，可促進損傷血管內(nèi)皮細胞的修復及增生，并促進側(cè)支循環(huán)的形成。HGF對血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生作用，血管密度的增加可明顯減輕血腦屏障的破壞，保護血腦屏障的完整性［13］，而不加重腦水腫［14］。HGF是嗜鉻細胞瘤P12細胞、鼠胚胎運動神經(jīng)元和胎鼠海馬神經(jīng)元的存活因子，能增強皮質(zhì)軸突的生長和促進、腦多巴胺能神經(jīng)元的存活［15］。它還可通過自分泌、旁分泌以及經(jīng)典的軸突逆向轉(zhuǎn)運方式，與特異性c-Met受體結(jié)合而起作用，其具體的作用機制尚不清楚，可能與cAMP介導的途徑有關(guān)。研究表明，大多數(shù)HGF陽性細胞能分泌多種營養(yǎng)因子的反應性星形膠質(zhì)細胞，因此HGF作為神經(jīng)營養(yǎng)因子可能在腦缺血后的修復和重塑中起重要作用［16-17］。

中醫(yī)學認為腦髓是由腎精化生而成，腎精是腦髓形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。缺血性中風好發(fā)于中老年人，蓋因中年之后腎精虧損，髓?？仗摚X絡(luò)失養(yǎng)，遂致腦絡(luò)血液凝澀不暢，發(fā)為中風。腎為一身之根本，髓海有病，其本在腎，所以治腎亦即治腦。故腎虛血瘀是缺血性中風發(fā)病的重要的病理機制之一。腎腦復元湯是根據(jù)從腎治腦、腎腦同治理論遣藥組方而成，方中大量補益藥與活血藥相配，使氣旺血行，活血不傷正，共奏補氣活血通絡(luò)之功，如此則精盛、髓滿、腦充、瘀散、絡(luò)暢、竅通，是經(jīng)臨床驗證對治療缺血性中風有良好療效的方藥，該方可明顯改善腦卒中患者的神經(jīng)功能，提高臨床療效，降低致殘率，提高生活質(zhì)量。

本實驗研究顯示，腎腦復元湯、hUC-MSCs均能促進缺血后神經(jīng)功能的恢復、促進HGF的表達，減輕缺血腦損傷，恢復神經(jīng)功能，腎腦復元湯主要在恢復期發(fā)揮其恢復神經(jīng)功能的作用，hUC-MSCs在各期均可發(fā)揮作用，二者聯(lián)合效果更佳。

此外，本實驗中，腎腦復元湯聯(lián)合HUC-MSCs移植治療未見明顯的不良反應，HE染色觀察各組腦組織未產(chǎn)生明顯腫瘤細胞及異形細胞的增生。因此本實驗也從另一方面驗證了腎腦復元湯聯(lián)合HUC-MSCs移植治療腦缺血再灌注損傷的安全性，而中藥聯(lián)合干細胞移植治療腦缺血性損傷的遠期療效及致瘤性尚需進一步研究。