張惠麗 成秋生 陳希 李澤

肌源性干細(xì)胞（muscle-derived stem cells，MDSCs）是指從骨骼肌組織中分離出來的具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞［1］。預(yù)貼壁法［2］是近十年來廣泛運(yùn)用的培養(yǎng)方法。但是，研究者［3-6］對細(xì)胞群的貼壁時(shí)間存在分歧，且作者都只提到貼壁4 ～5 d，而筆者的研究小組前期發(fā)現(xiàn)，同樣的操作方法及相同的試劑儀器，卻可以從正常人的腓腸肌組織中分離出貼壁6、7、8 d 的細(xì)胞群。為進(jìn)一步判斷貼壁時(shí)間更長的肌源性細(xì)胞是否還是屬于MDSCs，筆者重點(diǎn)比較貼壁6 d（D6-hMDCs）和貼壁8 d（D8-hMDCs）的慢貼壁細(xì)胞群與貼壁1 d的快貼壁細(xì)胞群（D1-hMDCs）的不同，這對闡明人的肌源性干細(xì)胞的生物特性具有重要的意義，能為細(xì)胞移植治療假肥大肌營養(yǎng)不良癥擴(kuò)大細(xì)胞來源提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物純合子mdx 配種鼠（C57BL/10Sc-Sn-DMDmdx）和正常C57BL/6 鼠。

1.2 主要試劑骨骼肌增殖培養(yǎng)基（Stem cell，加拿大）、TRIzol 試劑（Invitrogen，美國）、SYBR?PrimeScript?RT-PCR 試劑盒（Takara，日本）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織取材經(jīng)知情同意，取腓骨骨折患者的腓腸肌組織約5 g。

1.3.2 hMDCs 的分離及培養(yǎng)參照預(yù)貼壁法［2］分離細(xì)胞，首次鋪板2 h 后，將未貼壁細(xì)胞移入新培養(yǎng)瓶（2 h 內(nèi)貼壁的絕大部分是成纖維細(xì)胞），24 h后再次將未貼壁細(xì)胞移入新培養(yǎng)瓶，如此反復(fù)，直至分離出貼壁6 d 的“D6-hMDCs”和貼壁8 d 的“D8-hMDCs”。

1.3.3 免疫表型鑒定hMDCs 加入FITC 熒光標(biāo)記的小鼠抗人源CD117、CD184、CD45、CD114、CD56、CD146、CD34、CD44、CD73 和CD90，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原表達(dá)。

1.3.4 免疫熒光檢測制作細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，0.3%TritonX-100 破膜15 min，加入一抗desmin（1∶200，Abcom），Pax7（1∶150，Abcom）和MHC（1∶200，DSHB），4 ℃過夜，加入熒光標(biāo)記的二抗（1∶1 000，CST），室溫避光孵育1 h，DAPI 核染色，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.5 Real-time PCR 檢測成肌標(biāo)記收集細(xì)胞，提取RNA 后反轉(zhuǎn)為cDNA，PCR 檢測相關(guān)細(xì)胞因子。GAPDH 為內(nèi)參基因。

1.3.6 Western Blotting 檢測成肌標(biāo)記收集細(xì)胞，按Western Blotting 法檢測相關(guān)蛋白desmin（1∶7 000，Abcom），MHC（1∶500，DSHB）和Pax7（1∶500，Abcom），GAPDH（1∶8 000，CST）為內(nèi)參。

1.3.7 移植后mdx 鼠腓腸肌組織dystrophin 免疫熒光檢測將hMDCs 注射到mdx 鼠左側(cè)腓腸?。恐?0 μL），PBS 注射右側(cè)作為對照，2 周后取材。制成8 μm 冰凍切片，行dystrophin 染色，一抗DYS（1∶20，Abcom），具體方法參照1.3.4。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 進(jìn)行分析。數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較用方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫表型鑒定D6-hMDCs 和D8-hMDCs 表面標(biāo)記物表達(dá)幾乎一致。其中CD56、CD45 和CD184均呈顯著高表達(dá)（與D1-hMDCs 相比，P＜0.05）。

2.2 細(xì)胞免疫熒光顯示不同hMDCs 間的成肌能力有差別在增殖培養(yǎng)基（growth medium，GM）下，三者h(yuǎn)MDCs 的Pax7 及desmin 表達(dá)無差異；D6-hMDCs 和D8-hMDCs 的MHC 表達(dá)均顯著高于D1-hMDCs（均P＜0.05），但D6-hMDCs 和D8-hMDCs間沒有差異（圖1A）；經(jīng)分化培養(yǎng)基（differential medium，DM）誘導(dǎo)15 d 后，三者h(yuǎn)MDCs 的Pax7 表達(dá)無差異；D6-hMDCs 和D8-hMDCs 的desmin 及MHC表達(dá)均顯著高于D1-hMDCs（均P＜0.05），但D6-hMDCs和D8-hMDCs間沒有差異（圖1B）。

圖1 細(xì)胞免疫熒光檢測成肌標(biāo)志物的表達(dá)Fig.1 The expression of myogenetic marks in hMDCs by IF

2.3 Real-time PCR顯示不同hMDCs間的成肌能力有差別在GM下，MyoD1、myogenin、Myf5、α7-integrin和M-cadherin 的mRNA 表 達(dá) 在D6-hMDCs 和D8-hMDCs 上均顯著高于D1-hMDCs（均P＜0.05），但D6-hMDCs 和D8-hMDCs 間沒有差別（圖2A）。

經(jīng)DM 分化4 d，MyoD1、Myogenin、desmin 和MHC 的mRNA 表達(dá)在D6-hMDCs 和D8-hMDCs 上均顯著高于D1-hMDCs（均P＜0.05），但D6-hMDCs 和D8-hMDCs 間沒有差別（圖2B）。

2.4 Western Blotting顯示不同hMDCs間的成肌能力有差別在GM 下，MHC 蛋白水平在D6-hMDCs和D8-hMDCs 均顯著高于D1-hMDCs（均P＜0.05），且在D8-hMDCs 顯著高于D6-hMDCs（P＜0.05，圖3A）。

經(jīng)DM 分化7 d，desmin 和MHC 的蛋白水平在D6-hMDCs 和D8-hMDCs 均顯著高于D1-hMDCs，但在D8-hMDCs 與D6-hMDCs 間沒有差異（圖3B）。

圖2 不同細(xì)胞因子mRNA 相對表達(dá)水平Fig.2 Relative mRNA expression levels of different cytokines

2.5 移植不同hMDCs 后，dystrophin 蛋白表達(dá)有差異D6-hMDCs 組 和D8-hMDCs 組dystrophin 陽性率顯著高于D1-hMDCs 組（均P＜0.05），但D6-hMDCs 組和D8-hMDCs 組間沒有差異（圖4）。

3 討論

MDSCs 作為治療假肥大肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）明顯有效的干細(xì)胞來源之一［7］，從發(fā)現(xiàn)之初，就備受關(guān)注。目前研究者對MDSCs 培養(yǎng)所需的貼壁時(shí)間存在爭議，且最長貼壁時(shí)間為4～5 d［3-4］。而本研究發(fā)現(xiàn)貼壁6 d（D6-hMDCs）和8 d（D8-hMDCs）的慢貼壁細(xì)胞群，貼壁時(shí)間不一致，考慮與研究物種［8-9］、操作［5］、使用的器皿和試劑等［10］相關(guān)。

D6-hMDCs 和D8-hMDCs 的流式標(biāo)記物表達(dá)幾乎一致，提示兩者可能屬同一細(xì)胞群。MDSCs 呈CD56［11］、CXCR4［12］陽性，但CD45 陰性［13］。本研究發(fā) 現(xiàn)CD56 及CXCR4 在D6-hMDCs 和D8-hMDCs 呈高表達(dá)，提示兩者可能為MDSCs，但呈CD45（+），考慮與培養(yǎng)方法不盡相同［14］及標(biāo)記物隨著體外增殖分化而改變［15］有關(guān)。

圖3 成肌標(biāo)記物的表達(dá)水平Fig.3 Relative protein expression levels of myogenic markers

圖4 hMDCs 移植mdx 鼠后腓腸肌組織dystrophin 蛋白表達(dá)Fig.4 The dystrophin expression of gastrocnemius in mdx transplanted by hMDCs

無 論 是GM 還 是DM 培 養(yǎng) 下，D6-hMDCs 和D8-hMDCs 均比D1-hMDCs 表現(xiàn)出高表達(dá)成肌標(biāo)志物demsin［16］和MHC，這與文獻(xiàn)［3-4］報(bào)道的慢貼壁細(xì)胞群比快貼壁細(xì)胞群具有更強(qiáng)成肌能力相一致。

MyoD1、myogenin 和Myf5 是成肌誘導(dǎo)因子，在GM 下（未誘導(dǎo)分化條件下）出現(xiàn)表達(dá)水平上調(diào)，支持D6-hMDCs 和D8-hMDCs 更易于成肌分化。此外D6-hMDCs 和D8-hMDCs 高表達(dá)α7-integrin，且移植mdx 鼠后呈現(xiàn)更多dystrophin 陽性肌細(xì)胞，與文獻(xiàn)［17］報(bào)道α7-integrin 陽性的成肌祖細(xì)胞具有更強(qiáng)的再生潛能相符。D6-hMDCs 和D8-hMDCs 同樣表達(dá)高M(jìn)-cadherin 等肌衛(wèi)星標(biāo)記，提示MDSCs 和肌衛(wèi)星細(xì)胞的表面標(biāo)記物存在部分重疊。

Pax7 被認(rèn)為是經(jīng)典的靜息期和增殖期的肌衛(wèi)星細(xì)胞的標(biāo)記［18］，本研究中在GM 和在DM 下，三者h(yuǎn)MDCs 均完全表達(dá)pax7，推測pax7 不僅是肌衛(wèi)星細(xì)胞的標(biāo)記，還可能是肌源性干細(xì)胞的標(biāo)記。

移 植D6-hMDCs 和D8-hMDCs 的mdx 鼠腓腸肌出現(xiàn)的dystrophin 陽性肌纖維數(shù)較D1-hMDCs 明顯增多，但兩者間沒有差異，說明慢（晚）貼壁細(xì)胞群D6-hMDCs 和D8-hMDCs 比快貼壁細(xì)胞群D1-hMDCs 具有更強(qiáng)的肌肉再生能力。Dystrophin 陽性肌纖維表達(dá)量比CAO 等［4］報(bào)道表達(dá)量要低，但與CHIRIELEISON 等報(bào)道相似，考慮與供體細(xì)胞來源的種屬不同相關(guān)，間接說明人源MDSCs 與鼠源MDSCs 的生物特性有明顯不同。

總之，利用預(yù)貼壁法，從正常人腓腸肌組織中能分離出更慢貼壁的細(xì)胞群。慢貼壁的細(xì)胞群D6-hMDCs 和D8-hMDCs 具有相似的生物學(xué)特性，相比于D1-hMDCs，兩者具有更強(qiáng)的成肌分化能力，且移植mdx 鼠后能再生出更多dystrophin 陽性的肌纖維。