陳靖 葉偉標(biāo) 徐詠強(qiáng) 李妤玲 李仲均

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤。近年來，隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)［1］。結(jié)直腸癌起病較為隱匿，相當(dāng)一部分患者就診時(shí)已出現(xiàn)局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者臨床治療失敗和預(yù)后不佳的主要原因。因而，深入探索結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要的意義。環(huán)狀RNA（circRNA）是一類最近被重新認(rèn)識(shí)的具有特殊結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼RNA［2］。研究表明，circRNA 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和耐藥等過程中均起著重要的作用［3］。在前期研究中，筆者通過基因芯片篩選結(jié)直腸癌樣本中差異性表達(dá)的circRNA，其中circFAT1 的表達(dá)顯著上調(diào)。本研究擬檢測(cè)circFAT1 在結(jié)直腸癌腫瘤組織和腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，分析其與患者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性并探討其中可能的作用機(jī)制，為尋求結(jié)直腸癌治療新靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2010年1月至2014年12月在南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除結(jié)直腸癌患者85例，其中男49例，女36例，年齡為42～86 歲，平均為（62.5 ± 6.8）歲。所有納入本研究的病例術(shù)前均未接受放化療或生物免疫治療，術(shù)后經(jīng)組織病理切片證實(shí)為浸潤(rùn)性腺癌。結(jié)直腸癌的病理診斷參照2010年版《消化系統(tǒng)腫瘤WHO分類》。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 組織樣本和細(xì)胞系組織離體15 min 內(nèi)迅速切取靠近腫瘤邊緣處無壞死的癌組織，同時(shí)選取距離腫瘤邊緣＞5 cm 處的腸黏膜作為配對(duì)的癌旁正常腸黏膜組織。其中一份標(biāo)本裝入1.5 mL 的EP 管，置于液氮中保存；另一份標(biāo)本裝入塑料包埋盒，使用10%中性福爾馬林緩沖液固定36 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋備用。人腸癌細(xì)胞株LoVo購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。LoVo 細(xì)胞株采用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2及95%空氣飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 RNA提取及Real-time PCR采用TRIzol?Reagent 提取組織和細(xì)胞總RNA，利用NanoDrop2000微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 含量和濃度。應(yīng)用PrimeScript?RT Reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；使用TB Green?Fast qPCR Mix 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共40 個(gè)循環(huán)。circFAT1 上、下游引物序列分別為5′-GAGGACGCCAGAAGAGATGG-3′和5′-GCCAAATGTCTCCCCATTGC-3′。GAPDH 上、下游引物序列分別為5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′和5′-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3′。

1.4 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，用0.05%胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用LipofectamineTM3000 試劑將siRNA-circFAT1（siRNA-circFAT1 組）、Negative Control（NC 組）轉(zhuǎn)染至LoVo 細(xì)胞株，同時(shí)僅以LipofectamineTM3000 試劑轉(zhuǎn)染者作為空白對(duì)照（Blank 組）。轉(zhuǎn)染24 h 后，用無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基制成1 × 105/mL 的細(xì)胞懸液。取100 μL 接種于Transwell 上室，在Transwell 下室中加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)24 h 后，用棉簽擦去上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定后，DAPI 染色標(biāo)記腫瘤細(xì)胞核，100 倍鏡下隨機(jī)取5 個(gè)視野，計(jì)算遷移細(xì)胞平均數(shù)目。進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，預(yù)先將Matrigel 膠稀釋后包被Transwell 上室，室溫放置6 h，其余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 軟件。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)（四分位間距）表示。正態(tài)分布數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。circFAT1 與臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 隨訪患者通過門診復(fù)查和電話隨訪，截止時(shí)間為2018年6月30日。

2 結(jié)果

2.1 circFAT1 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，circFAT1 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁正常腸黏膜組織（P＜0.05，圖1）。熒光原位雜交檢測(cè)結(jié)果顯示，circFAT1 主要分布在細(xì)胞質(zhì)。

圖1 circFAT1 在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常腸黏膜組織中的表達(dá)Fig.1 The expression levels of circFAT1 in CRC and adjacent normal mucosa

2.2 circFAT1 的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性分析在納入本研究的85例結(jié)直腸癌中，circFAT1 的表達(dá)水平與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位、腫瘤分化程度等無顯著的相關(guān)性（P＞0.05，表1）。生存分析顯示，circFAT1 低表達(dá)的患者較circFAT1高表達(dá)的患者預(yù)后好，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007 5，圖2）。

圖2 circFAT1 高表達(dá)組與低表達(dá)組之間Kaplan-Meier 生存曲線比較Fig.2 Comparision of survival curves（Kaplan-Meier）between circFAT1 low expression group and circFAT1 high expression group

表1 circFAT1 表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Correlations of circFAT1 expression with clinicopathological features in patients with CRCM（P25，P75）

2.3 siRNA-circFAT1轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-circFAT1后LoVo細(xì)胞株中circFAT1表達(dá)量明顯下降，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 Real-time PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中circFAT1 表達(dá)水平Fig.3 The expression levels of circFAT1 in different groups after infection

2.4 circFAT1 對(duì)腸癌細(xì)胞株遷移和侵襲能力的影響Transwell 小室裝置檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-circFAT1后LoVo 細(xì)胞株的遷移和侵襲能力明顯減弱，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4、5）。

圖4 敲低circFAT1 表達(dá)對(duì)LoVo 細(xì)胞遷移能力的影響Fig.4 The effect of siRNA-circFAT1 on LoVo cell migration

圖5 敲低circFAT1 表達(dá)對(duì)LoVo 細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.5 The effect of siRNA-circFAT1 on LoVo cell invasion

3 討論

結(jié)直腸癌是近年來發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的腫瘤流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（GLOBOCAN），2018年在全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌的新增病例數(shù)超過180 萬［1］。在我國(guó)由于腸癌早期篩查措施尚未普及，約有25%患者就診時(shí)已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。此外，30%～50%患者在行腸癌根治性切除術(shù)后仍會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移［4］。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征，亦是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要原因之一。針對(duì)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和治療策略已成為當(dāng)前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

circRNA 是一類具有特殊結(jié)構(gòu)和功能的非編碼RNA，可通過充當(dāng)miRNA 海綿或與RNA 結(jié)合蛋白相互作用等方式，參與靶基因的表達(dá)調(diào)控［5-7］。circRNA 與個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝以及疾病發(fā)生均有著密切的關(guān)系［8-12］。早在2013年，HANSEN 等［13］率先鑒定了在人和小鼠腦中以較高豐度存在的環(huán)狀RNA 分子ciRS-7/CDR1as，發(fā)現(xiàn)其具有數(shù)量眾多的保守性結(jié)合位點(diǎn)，可與miR-7 特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。此后，MEMCZAK 等［14］在對(duì)斑馬魚的研究中進(jìn)一步證實(shí)了過表達(dá)ciRS-7/CDR1as 可減少中腦體積，影響腦發(fā)育。隨著研究的不斷深入，circRNA 在代謝性疾病和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用受到越來越多的關(guān)注［15-19］。目前已有多個(gè)研究報(bào)道在肝癌、肺癌、乳腺癌等人類腫瘤組織中普遍存在異常表達(dá)的circRNA［20-23］。

circFAT1 是一種新近發(fā)現(xiàn)的circRNA，其對(duì)應(yīng)基因定位于人類4 號(hào)染色體長(zhǎng)臂（4q35.2）。在前期實(shí)驗(yàn)中，筆者通過基因芯片分析結(jié)直腸癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織的circRNA 表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)circFAT1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和原位雜交技術(shù)對(duì)85例不同臨床分期的結(jié)直腸癌進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證了circFAT1 在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)。分析circFAT1 與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中circFAT1 表達(dá)水平高的患者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，circFAT1 表達(dá)上調(diào)可能與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。為此，筆者進(jìn)一步觀察了circFAT1 對(duì)腸癌細(xì)胞株侵襲和遷移能力的影響；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，下調(diào)circFAT1 可抑制腸癌細(xì)胞株侵襲和遷移。上述結(jié)果提示，circFAT1 可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲參與結(jié)直腸癌的惡性演進(jìn)。