何遠麗， 任彪， 陳璇， 鄒玲

1.口腔疾病研究國家重點實驗室國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，四川 成都（610041）；2.口腔疾病研究國家重點實驗室國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，四川 成都（610041）

變異鏈球菌是主要致齲菌，其耐受各種環(huán)境應(yīng)激的能力是它在牙菌斑生物膜中的競爭優(yōu)勢之一［1］。牙菌斑是一個復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境，菌斑中氧的含量水平約為大氣中的10%，這些活性氧（reactive oxygen species，ROS）的累積會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA、膜脂質(zhì)損傷以及酶失活。為應(yīng)對上述環(huán)境壓力變化，變異鏈球菌通過調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)如雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（two-component signal transduction systems，TCSTS）、CcpA-依賴和非依賴的碳代謝阻遏（carbon catabolite repression，CCR）、群體感應(yīng)信號機制（quorum-sensing，QS）增強其環(huán)境適應(yīng)性，在牙菌斑波動性環(huán)境中良好生存并繁殖［1］。研究表明，氧化應(yīng)激會影響細菌的遺傳轉(zhuǎn)化以及與感受態(tài)相關(guān)的多重基因表達［2］。而變異鏈球菌控制遺傳轉(zhuǎn)化的調(diào)控通路與許多毒力相關(guān)基因的表達相互影響。分選酶A（Sortase A，SrtA）是革蘭陽性菌中的一類轉(zhuǎn)肽酶，變異鏈球菌中的SrtA 可對其底物蛋白SpaP、GbpC、DexA、FruA、WapA、WapE 的LPXTG 序列進行分選識別，將這些表面蛋白共價錨定于細胞壁上，在變異鏈球菌的黏附過程中起重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)其編碼基因srtA 缺失后細菌初始黏附率降低、生物膜結(jié)構(gòu)松散、致齲能力減低［3］。本課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)srtA基因缺失影響變異鏈球菌細胞外多糖合成及耐酸能力，推測這些影響與srtA 基因缺失后復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控相關(guān)［4-5］，且變異鏈球菌srtA 基因很有可能影響其氧化耐受能力。因此，本研究擬探索srtA 對變異鏈球菌氧化耐受能力的影響，并通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-sequence，RNA-seq）與實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）來初步探討其機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

牛腦心浸液培養(yǎng)基（Oxiod，英國）；壯觀霉素（Sigma，美國）；3%過氧化氫（Sigma，美國）；過氧化氫酶（Sigma，美國）；Nanodrop 分光光度儀（Thermo Scientific，美國）；IlluminaHiseq 4 000 測序平臺（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，中國）；Trizol 裂解液（Life Technologies，美國）；PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser（TaKaRa，日本）；TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNase H Plus）（TaKaRa，日本）；LightCycler480 熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士）。變異鏈球菌UA159（Streptococcus mutans UA159）由口腔疾病研究國家重點實驗室提供，保存于-80 ℃。變異鏈球菌UA159 菌株srtA 基因缺失株及回復(fù)株由本課題組前期研究構(gòu)建［5-6］。

1.2 菌株培養(yǎng)

變異鏈球菌UA159、變異鏈球菌UA159 菌株srtA 基因缺失株（ΔsrtA）及回復(fù)株（ΔsrtAcomp）各菌株分別接種于牛腦心浸液（brain heart infusion broth，BHI）培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)條件下過夜復(fù)蘇后，劃線接種于BHI 固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后4 ℃儲存?zhèn)溆谩Ｆ渲?，ΔsrtAcomp 接種于含有濃度為1 000 μg/mL 壯觀霉素的BHI 培養(yǎng)基，余同上。細菌經(jīng)菌落形態(tài)學(xué)、細胞形態(tài)學(xué)鑒定為變異鏈球菌。將UA159、ΔsrtA、ΔsrtAcomp 單菌落過夜培養(yǎng)，1∶20 稀釋于BHI 中培養(yǎng)3 h 后，調(diào)整菌液600 nm 光密度為0.5，即為“對數(shù)中期細菌”。將1∶20稀釋后細菌培養(yǎng)至24 h，即為“穩(wěn)定期細菌”。將對數(shù)中期菌液繼續(xù)1∶20 稀釋于含有1%蔗糖的BHI培養(yǎng)基中，分別加入24 孔板，培養(yǎng)24 h 以產(chǎn)生穩(wěn)定期生物膜。

1.3 浮游菌氧化耐受

將UA159 及ΔsrtA、ΔsrtAcomp 菌株培養(yǎng)至對數(shù)中期，離心收菌、去上清，等體積1 mL 無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH＝7.0）重懸，振蕩混勻，再次離心、去上清。將3%過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）用無菌PBS 緩沖液稀釋至0.05%終濃度［7］。然后向各管中分別加入等體積含0.05% H2O2的無菌PBS 緩沖液重懸細菌團塊，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)條件下分別培養(yǎng)0、15、30、60 min后，加入5 mg/mL H2O2酶終止反應(yīng)［8］，震蕩混勻，用無菌PBS 進行濃度梯度稀釋，每樣取10 μL 于BHI瓊脂平板點樣，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2 d 后菌落計數(shù)，計算各樣本存活率的對數(shù)轉(zhuǎn)換結(jié)果并繪制其隨時間變化折線圖，比較其統(tǒng)計學(xué)差異。

1.4 生物膜氧化耐受

培養(yǎng)UA159 及ΔsrtA、ΔsrtAcomp 菌株至穩(wěn)定期生物膜狀態(tài)，吸棄上清液，無菌PBS 緩沖液潤洗孔板底部生物膜3 次，將每菌種6 平行孔分為A、B組（各3 孔）。各菌A 組每孔即刻加入2 mL PBS 緩沖液，各菌B 組每孔即刻加入2 mL 含0.05% H2O2的無菌PBS 緩沖液后于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)60 min。A 組即刻刮取生物膜，為“無刺激組”；B組培養(yǎng)60 min 后刮取生物膜，為“刺激組”。震蕩混勻，5 000 rpm 離心10 min，去上清、PBS 重懸，再次離心、重懸；震蕩混勻，從各組各孔中分別吸取100 μL 菌液用無菌PBS 進行濃度梯度稀釋，取合適稀釋倍數(shù)的菌液100 μL 涂布于BHI 瓊脂平板，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 d 后菌落計數(shù)，計算各樣本CFU/mL 的對數(shù)轉(zhuǎn)換結(jié)果并比較其統(tǒng)計學(xué)差異。

1.5 RNA-seq 與數(shù)據(jù)分析

將UA159 和ΔsrtA 對數(shù)中期組、穩(wěn)定期組菌液培養(yǎng)至預(yù)定生長時間后，提取樣本總RNA。使用Nanodrop 分光光度儀檢測所得樣本RNA 的純度及濃度，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA 質(zhì)量。本實驗RNA-Seq 檢測及原始數(shù)據(jù)質(zhì)控均委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，RNA 建庫、富集，采用IlluminaHiseq 4 000 測序 平臺 行2 × 150 bp 測 序。參考Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫及KEGG 數(shù)據(jù)庫對測序所得同源基因轉(zhuǎn)錄本進行功能注釋。使用軟件RSEM 以FPKM 為單位計算樣本中各基因表達量。以顯著性FDR ＜0.05，變化倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）絕對值≥2 為篩選標(biāo)準，計算對數(shù)中期及穩(wěn)定期ΔsrtA 相對UA159 的基因差異表達狀況，差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）若在ΔsrtA樣本中表達量高于UA159 樣本，則為表達上調(diào)基因，反之則為表達下調(diào)基因。

通過文獻查閱，本實驗篩選了與變異鏈球菌氧化耐受相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)和編碼細胞內(nèi)H2O2合成酶、代謝解毒酶類等相關(guān)基因共33 個，其中TCSTS 基因17 個、H2O2合成酶編碼基因3 個、H2O2代謝酶編碼基因8 個以及其他［9］對氧化耐受有潛在影響的基因與調(diào)控子5 個。分別分析這33 個基因在對數(shù)中期及穩(wěn)定期各樣本中的轉(zhuǎn)錄水平。

1.6 氧化耐受相關(guān)基因的qPCR 驗證

將UA159 和ΔsrtA 對數(shù)中期菌液1∶20 稀釋于含有1%蔗糖的BHI 培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)至對數(shù)中期、穩(wěn)定期后，離心收菌，提取細菌總RNA，然后使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。選用16S rRNA［10］作為內(nèi)參引物，選用RNA-seq 結(jié)果中FDR ＜0.05、|FC| ≥2 的DEGs 作為目的基因。本研究所用引物序列見表1，其中l(wèi)rgB、lytT引物序列參考Ahn等［11］的研究設(shè)計，其余引物序列使用Primer 3 Plus 設(shè)計。根據(jù)TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNase H Plus）說明書加樣，各基因引物設(shè)置不含cDNA 的陰性對照。通過LightCycler 480IISystem 程序上機擴增，獲得各目的基因及內(nèi)參基因的CT（cycle threshold）值。采用2-ΔΔCT法對目的基因的相對表達水平進行計算分析，得到各目的基因差異表達情況。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析均用SPSS 17.0 軟件完成。用Levene′s test 對樣本進行方差齊性檢驗，若樣本方差齊，則進行兩獨立樣本t 檢驗或單因素方差分析，若樣本方差不齊，則進行Kruskal-wallis 非參數(shù)檢驗，P ＜

0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 srtA 基因缺失株影響浮游狀態(tài)變異鏈球菌氧化耐受能力

H2O2刺激UA159 和ΔsrtA、ΔsrtAcomp 菌株浮游菌0、15、30、60 min 后3 菌種平板生存率的對數(shù)轉(zhuǎn)換結(jié)果隨時間變化情況如圖1 所示，可見UA159 和ΔsrtA、ΔsrtAcomp 菌株的存活率隨氧化刺激時間增加而降低。ΔsrtA 在H2O2刺激15 min 時存活率無明顯變化（P＞0.05）；在H2O2刺激30、60 min 后，ΔsrtA、ΔsrtAcomp 存活率低于UA159（P＜0.05）。

2.2 srtA 基因缺失株生物膜狀態(tài)耐氧化能力下降

生物膜狀態(tài)各菌株受H2O2刺激前后的菌落計數(shù)結(jié)果如圖2 所示，srtA 基因缺失后穩(wěn)定期生物膜狀態(tài)變異鏈球菌氧化耐受能力下降（P＜0.05）。在無刺激組，UA159 和ΔsrtA、ΔsrtAcomp 菌落計數(shù)結(jié)果分別為2.38×106、1.28×106、8.00×106，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在刺激組，ΔsrtA 在過氧化氫刺激1 h 后被完全殺滅，低于此時UA159 及ΔsrtAcomp 組的活菌菌落計數(shù)（P＜0.05），此時ΔsrtAcomp組活菌菌落計數(shù)也低于UA159（P＜0.05）。

2.3 srtA 基因缺失影響轉(zhuǎn)錄組中氧化耐受相關(guān)基因的表達水平

在對數(shù)中期ΔsrtA 樣本中，有31 個氧化耐受相關(guān)基因呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄水平改變的趨勢（圖3a），其中，有15 個基因趨于上調(diào)，16 個基因趨于下調(diào)，但其F C 均低于本次篩選閾值，故對數(shù)中期樣本中未見細胞氧化耐受相關(guān)基因差異表達。

Figure 1 Oxidation tolerance results for the UA159，ΔsrtA and ΔsrtAcomp strains in the planktonic state圖1 UA159 和ΔsrtA、ΔsrtAcomp 菌株浮游狀態(tài)耐氧化結(jié)果

在穩(wěn)定期ΔsrtA 樣本中（圖3b），雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)編碼基因lrgA、lrgB、lytT 表達顯著下調(diào)（2.2～2.4 倍），comC 表達顯著上調(diào)（2.1 倍）。其余14 個基因趨于上調(diào)，15 個基因趨于下調(diào)，但其基因表達水平波動范圍在本次分析閾值以下。

Figure 2 Oxidation tolerance results for the UA159,ΔsrtA and ΔsrtAcomp strains in the biofilm state圖2 UA159 和ΔsrtA、ΔsrtAcomp 菌株生物膜狀態(tài)耐氧化結(jié)果

2.4 srtA 基因缺失降低TSCTS 相關(guān)基因的表達水平

Figure 3 Differential expression levels of oxidation tolerance-related genes in the exponential and stationary phase samples upon srtA deletion圖3 srtA 基因缺失后氧化耐受相關(guān)基因在對數(shù)中期及穩(wěn)定期的差異表達水平

將上述轉(zhuǎn)錄結(jié)果中差異表達的TSCTS 編碼基因lrgB、lytT 以及既往研究［1，12］顯示與氧化耐受顯著相關(guān)的vicK 通過qPCR 驗證其差異表達情況。結(jié)果顯示，ΔsrtA 菌株的lytT、lrgB、vicK 基因在對數(shù)中期、穩(wěn)定期的表達水平均較UA159 降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.001）。如圖4 所示，ΔsrtA 菌株的vicK 在對數(shù)中期、穩(wěn)定期分別下調(diào)10.88、6.57倍，lrgB 下調(diào)28.57、53.51 倍，lytT 下調(diào)21.41、11.01倍，其差異表達趨勢與穩(wěn)定期RNA-Seq 結(jié)果一致。

Figure 4 Differential expression of TSCTS-related genes according to the ΔsrtA strain RNA-seq and qPCR profiles圖4 ΔsrtA 菌株的TSCTS 相關(guān)基因在RNA-seq 與qPCR 中的差異表達水平

3 討 論

變異鏈球菌形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使之能夠更好地耐受氧化壓力，也為其應(yīng)對口腔牙菌斑復(fù)雜微生態(tài)環(huán)境中大量的ROS，如H2O2等提供了優(yōu)勢。變異鏈球菌的H2O2合成酶相對缺乏，但其擁有NADH 氧化酶Nox 和烷基氫過氧化物酶（alkylhydroperoxidase，AhpF）；Nox 和AhpF 的胞內(nèi)呼吸作用能夠?qū)ADH 氧化為NAD+、將氧還原為H2O或H2O2［13］。本研究發(fā)現(xiàn)srtA 基因缺失后，對數(shù)中期及穩(wěn)定期變異鏈球菌樣本中，nox、ahpF 和推定的AhpF 編碼基因smu_961 表達水平均略有下調(diào)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示srtA 基因缺失并未對變異鏈球菌的胞內(nèi)呼吸作用造成顯著影響。

變異鏈球菌基因組編碼了眾多不同的脫氫酶和過氧化物酶，如谷胱甘肽氧化還原酶［14］（glutathione oxidoreductase，Gor）、硫醇過氧化物酶，以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，Sod）等來分解代謝胞內(nèi)ROS。sod、gor 和硫醇過氧化物酶編碼基因tpx在ΔsrtA對數(shù)中期略有下調(diào)，其它NADH脫氫酶的編碼基因smu_346、smu_543、smu_1089、smu_179 等轉(zhuǎn)錄水平變化也不顯著，提示srtA 基因缺失沒有對胞內(nèi)ROS代謝解毒酶類造成直接影響。

變異鏈球菌典型的調(diào)控系統(tǒng)TCSTS 和CCR 以及群體感應(yīng)機制QS 等可以增強變異鏈球菌的環(huán)境適應(yīng)性［1］，有文獻報道ScnRK 系統(tǒng)、LiaRS 系統(tǒng)對酸刺激及氧化耐受等有明顯的調(diào)控作用［15］，CiaRH、ComCDE、ComRS 等也可影響其H2O2耐受性［16］。但本研究結(jié)果顯示，srtA 基因缺失后，對數(shù)中期及穩(wěn)定期變異鏈球菌樣本中l(wèi)iaRS、scnRK、comX 略有下調(diào)，ciaRH、comR、comDE 略有上調(diào)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；TCSTS 基因comC 在穩(wěn)定期顯著上調(diào)2.1倍。據(jù)研究顯示，comC 編碼產(chǎn)物為QS 通路中ComDE 的信號肽的前體肽，comC 基因?qū)毫γ舾星夷軌蛘{(diào)控變異鏈球菌內(nèi)眾多基因的表達［15-16］。推測comC 在ΔsrtA 穩(wěn)定期中表達上調(diào)可能是因為該信號肽對H2O2刺激壓力的響應(yīng)，從而將該刺激信號傳導(dǎo)入細菌整體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以便細菌做出相應(yīng)的調(diào)控。

雙組分系統(tǒng)LytST 與細菌細胞壁代謝相關(guān)［14］，LrgAB 的表達對復(fù)雜和不利的環(huán)境信號高度敏感，與氧化耐受性、熱應(yīng)激、抗生素耐藥等毒力因素相關(guān)［17］，另外，LrgAB 據(jù)推測與噬菌體holin 蛋白有相似性［18］，在適應(yīng)環(huán)境壓力時能調(diào)節(jié)誘導(dǎo)亞群細胞死亡、裂解，從而有利于整個群體的生存。本研究中l(wèi)rgA、lrgB、lytT 在ΔsrtA 穩(wěn)定期的表達水平顯著下調(diào)2.2～2.4 倍，進一步qPCR 驗證lrgB、lytT 下調(diào)11.01～53.51 倍。說明srtA 基因缺失影響了變異鏈球菌以lrgAB、lytST 為主的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而將信號整合到細胞整體水平；同時lrgAB 的下調(diào)也反應(yīng)出ΔsrtA 對自身誘導(dǎo)死亡、裂解的負向調(diào)控，但作用較弱，故而ΔsrtA 氧化耐受性仍下降。

此外，據(jù)報道VicRK 系統(tǒng)對氧化應(yīng)激也有著明顯的調(diào)控作用［12］，能夠顯著影響變異鏈球菌的H2O2耐受能力。雖然本研究中對數(shù)中期及穩(wěn)定期ΔsrtA 的vicRK 變化水平均不顯著，但基于既往大量研究對VicRK 系統(tǒng)對氧化應(yīng)激調(diào)控作用的肯定，本次實驗選取了vicK（smu_1516）基因進行qPCR 實驗。結(jié)果表明ΔsrtA 菌株的vicK 在對數(shù)中期、穩(wěn)定期分別下調(diào)10.88 與6.57 倍，提示vicK 的差異表達在srtA 基因缺失株的氧化耐受能力降低中發(fā)揮著一定的調(diào)控作用；與上述lrgAB、lytST 的差異表達信號傳遞模式相似，這可能與信號整合到細胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān)。

綜上所述，srtA 基因缺失后，變異鏈球菌過氧化物合成及代謝酶類編碼基因表達水平不變，但氧化耐受相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子表達水平下降，進而減弱變異鏈球菌的氧化耐受能力，但具體的作用機制仍需進一步探討。