杜 漸，宋英茜，劉一平，羅海峰，譚 廣

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，遼寧 大連 116011)

胰腺癌是一種高度惡性的消化道腫瘤，其5年生存率為7%，中位存活時間僅為4～6個月[1]。手術(shù)及放化療不能明顯提高患者的5年生存率，因此腫瘤免疫治療現(xiàn)已成為研究熱點[2]。樹突狀細(xì)胞(DC)是目前發(fā)現(xiàn)功能最強大的抗原遞呈細(xì)胞，在抗原遞呈、T細(xì)胞活化等方面起重要的作用，成為腫瘤免疫研究的重點[3]。研究表明，胰腺癌組織內(nèi)存在大量的纖維化間質(zhì)，內(nèi)含多種細(xì)胞因子，形成有利于腫瘤細(xì)胞增殖和發(fā)展的微環(huán)境，使DC免疫功能明顯受抑，從而極大限制了各種DC疫苗的療效及臨床應(yīng)用[4-5]。趨化因子C-X-C配體5(chemokines C-X-C motif ligand 5，CXCL5)是CXC趨化因子家族成員之一，在機體的炎癥反應(yīng)及腫瘤血管生成中扮演重要角色[6]。研究表明，CXCL5在結(jié)直腸癌、膽管細(xì)胞癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤組織微環(huán)境中高表達，并且與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)[7-9]。但目前CXCL5在胰腺癌微環(huán)境下的表達情況，及其對DC免疫功能的影響卻鮮有報道。本研究選取38例胰腺癌患者手術(shù)標(biāo)本，分析CXCL5表達與腫瘤患者臨床病理特征及總生存率的關(guān)系；同時提取胰腺癌細(xì)胞上清液模擬腫瘤微環(huán)境，探討CXCL5對DC免疫功能的影響，為增強胰腺癌免疫治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

人胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3、Panc-1、AsPC-1購自ATCC公司，人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6-C7購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫，GM-CSF、IL-12p70、IL-4、TNF-α購自美國Peprotech公司；PE-CD86，F(xiàn)ITC-CD1a、CD80購自美國 Biolegend公司；淋巴細(xì)胞分離液購自挪威Axis-shield公司；CD14+免疫磁珠購于德國Miltenyi公司；流式細(xì)胞分析試劑盒購自日本Takara公司；ELISA試劑盒購于美國R&D公司；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于GIBCO公司； CXCL5、β-actin單克隆抗體購于BD公司；Lip2000購自Invitrogen公司；CXCL5的特異性shRNA片段購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。

1.2 臨床標(biāo)本

收集2010年3月至2013年3月間于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科行胰腺癌切除術(shù)患者組織標(biāo)本38例。其中男性25例，女性13例；年齡47～74歲，中位年齡61歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前未進行任何放化療或其他治療；(2)術(shù)后病理學(xué)確診為胰腺癌；(3)均為根治性切除，切緣無癌殘留；(4)臨床及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者同時存在其他部位腫瘤；(2)組織標(biāo)本及術(shù)后病理不符合本次研究者；(3)臨床及隨訪資料不完整者。38例胰腺癌標(biāo)本均選取對應(yīng)的癌旁組織作為對照?；颊咝g(shù)后均接受以吉西他濱為主的單藥化療，術(shù)后隨訪時間為6～60個月。所有標(biāo)本收集前均已獲得患者知情同意，并且獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

胰腺癌細(xì)胞系的培養(yǎng)及BxPC-3細(xì)胞上清液(BxCM)的制備詳見本課題組此前研究[10]。DC按下列不同的培養(yǎng)方法分為3組：取健康人(本課題組志愿者，均知情同意，且經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn))外周血，分離液梯度離心，經(jīng)免疫磁珠過濾獲得CD14+單核細(xì)胞；加入含GM-CSF(1000 U/mL)、 IL-4(500 U/mL)的RPMI1640培養(yǎng)基，隔天半量換液，第5天再加入TNF-α(800 U/mL)培養(yǎng)2 d，獲得正常成熟DC，作為對照組(ctrl組)；將BxCM按30%比例加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)DC，作為BxCM組；將CXCL5特異性shRNA片段轉(zhuǎn)染至BxPC-3細(xì)胞內(nèi)，獲取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液，按上述比例及方法培養(yǎng)DC，作為shCXCL5組。

1.3.2 免疫組化

標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟脫水，3%H2O2滅活、PBS洗滌處理后，加入一抗(1∶100)，4 ℃過夜；PBS洗滌3次，加入二抗(1∶2000)，37 ℃反應(yīng)30 min。PBS洗滌后DAB顯色。顯微鏡下閱片，以陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比進行評分，陽性細(xì)胞<5%為0分，5%～20%為1分，21%～40%為2分，41%～60%為3分，61～80%為4分，81%～100%為5分。

1.3.3 ELISA檢測CXCL5、IL-12p70的分泌情況

操作步驟具體按試劑盒說明書進行：將50 μL樣品及標(biāo)準(zhǔn)蛋白按不同濃度加入每孔中，室溫孵育2 h，洗滌后分別加入CXCL5和IL-12p70 conjugate室溫水浴2 h。依次加入Substrate solution、Stop solution。在450 nm下測定每孔的吸光值。

1.3.4 shRNA抑制CXCL5表達

CXCL5特異性shRNA片段: TTGTTTACAGACCACGCAA。以非特異性shRNA片段作為對照，使用Lip2000轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，具體操作按說明書進行，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.3.5 Western blot檢測細(xì)胞CXCL5蛋白的表達

收集各組細(xì)胞，PBS洗滌、離心，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)模。按CXCL5 1∶500的比例稀釋一抗，4 ℃過夜。室溫下PBST洗滌3次，加入按1∶5000稀釋的二抗，37 ℃震蕩孵育1 h。結(jié)合完畢后，PBST洗滌3次，化學(xué)發(fā)光，顯影，定影，膠片圖像掃描，使用Image分析軟件進行半定量分析。

1.3.6 體外CTL殺傷實驗

按照我們此前的實驗方法[10]制備T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，以BxPC-3細(xì)胞作為靶細(xì)胞，效靶比分別按50∶1、25∶1、12∶1、6∶1共同培養(yǎng)48 h，LDH釋放法測定各組490 nm處光密度值(OD)值并計算CTL殺傷活性。殺傷活性=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(實驗組最大OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 CXCL5在人胰腺癌組織和細(xì)胞上清液中的表達

免疫組化結(jié)果顯示：與癌旁組織相比，腫瘤組織中CXCL5的表達顯著增高(4.448 vs. 1.910，P<0.05)(圖1A)。ELISA結(jié)果表明，CXCL5在3株胰腺癌細(xì)胞系上清液中表達均明顯高于HPDE6-C7細(xì)胞系(圖1B)。本實驗選取CXCL5表達量最高的BxPC-3細(xì)胞上清液進行后續(xù)實驗。

A：免疫組化結(jié)果(×100)； B：細(xì)胞上清液中CXCL5表達情況。*：與HPDE6-C7比較，P<0.05圖1 胰腺癌組織和細(xì)胞中CXCL5的表達情況Fig 1 Expression of CXCL5 in pancreatic cancer tissues and cells

2.2 CXCL5與胰腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

依據(jù)CXCL5在38例胰腺癌組織中的中位表達水平，將患者分為高、低兩組。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，CXCL5的表達與胰腺癌TNM分期、血管侵犯有關(guān)(均P<0.05)，見表1。CXCL5高表達患者的總生存率明顯低于低表達者(5.263% vs. 26.36%,P<0.05)。見圖2。

2.3 CXCL5對DC成熟及IL-12p70分泌的影響

Western blot及ELISA檢測顯示，shRNA能夠顯著抑制BxPC-3細(xì)胞CXCL5的表達和分泌(均P<0.05)(圖3)。流式細(xì)胞儀檢測顯示，BxCM組DC成熟相關(guān)表型的表達均明顯低于ctrl組，而shCXCL5組DC各表型表達則顯著高于BxCM組(均P<0.05)(圖4A～C)。同時ELISA結(jié)果表明，BxCM組IL-12p70表達較ctrl組明顯降低；與BxCM組相比，shCXCL5組IL-12p70表達顯著增加(均P<0.05)(圖4D)。

表1 CXCL5表達與胰腺癌臨床病理因素的關(guān)系

Tab 1 Relations of CXCL5 expression with clinicopathologic variables of pancreatic cancer (n)

臨床病理因素高表達組(n=19)低表達組(n=19)P年齡(歲)0.461 ≤651513 >6546性別0.305 男1114 女85TNM分期0.022 Ⅰ～Ⅱ512 Ⅲ～Ⅳ147血管侵犯0.049 有115 無814分化程度0.194 高、中128 低711

圖2 不同CXCL5表達水平胰腺癌患者的生存曲線Fig 2 Survival curves of pancreatic cancer patients with different CXCL5 expression levels

2.4 CXCL5對DC免疫功能的影響

CTL殺傷活性分析顯示，BxCM組殺傷率顯著低于ctrl組；與BxCM組相比，shCXCL5組殺傷率明顯增高(均P<0.05)。見圖5。

3 討 論

近年來研究表明，CXCL5在多種惡性腫瘤中均過度表達，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[11]。Zhou等[12]發(fā)現(xiàn)，CXCL5在胃癌中表達顯著增高，并通過激活CXCR2/STAT3通路促進胃癌轉(zhuǎn)移。Roca等[13]發(fā)現(xiàn)，CXCL5通過促進機體的炎癥反應(yīng)，進而加快前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移。Haider等[14]也發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中CXCL5的表達明顯增高，并且與腫瘤分期及不良預(yù)后密切相關(guān)。但目前CXCL5在胰腺癌中的表達及功能尚研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，CXCL5在人胰腺癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織，同時發(fā)現(xiàn)不同胰腺癌細(xì)胞系上清液中CXCL5的表達也明顯高于正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。上述結(jié)果表明，胰腺癌中CXCL5的表達及分泌均異常增多，這與CXCL5在其他惡性腫瘤中的表達相類似。臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)，CXCL5表達與胰腺癌TNM分期、血管侵犯顯著相關(guān)；CXCL5高表達組患者的總生存率較低表達組明顯降低。這與Li等[15]的研究結(jié)果相一致。上述結(jié)果表明， CXCL5作為一種潛在的分子標(biāo)志物，對判斷胰腺癌的惡性程度及預(yù)后可能具有較為重要的臨床意義。

A：BxPC-3細(xì)胞中CXCL5表達情況；B:BxPC-3細(xì)胞上清液中CXCL5表達情況。*：與ctrl組比較，P<0.05圖3 shRNA對BxPC-3細(xì)胞CXCL5表達的抑制Fig 3 Inhibition of shRNA on the expression of CXCL5 in BxPC-3 cells

A：CD1a表達；B：CD80表達；C：CD86表達；D：IL-12p70分泌情況。*：與ctrl組比較，P<0.05；**：與BxCM組比較，P<0.05圖4 各組DC成熟相關(guān)表型的表達及IL-12p70分泌情況Fig 4 Expression of immunologic markers and IL-12p70 secretion in different DC groups

圖5 各組DC介導(dǎo)的CTL反應(yīng) Fig 5 CTL response induced by DC in different groups

腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及多種免疫細(xì)胞構(gòu)成，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展必不可少[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中存在CXCL5、CCL2、CXCL1、LDHA等諸多細(xì)胞因子，能夠促進腫瘤生長、增殖和血管生成[19-20]，在免疫抑制及腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用。多項研究對腫瘤微環(huán)境下機體免疫功能受損的機制已有一定闡明，即 DC生存力與免疫功能下降是其中主要原因之一[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌微環(huán)境下DC的成熟及免疫功能受到抑制，但微環(huán)境中何種細(xì)胞因子發(fā)揮作用卻未闡明[23]。為進一步探明其中機制，本研究采用BxCM體外模擬胰腺癌微環(huán)境，檢測微環(huán)境下CXCL5對DC免疫功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與ctrl組相比，胰腺癌微環(huán)境下 DC成熟、IL-12p70的分泌及其介導(dǎo)的CTL反應(yīng)均受到明顯抑制。研究證實，IL-12p70可誘導(dǎo)機體Th1型免疫應(yīng)答，進而產(chǎn)生CTL殺傷腫瘤細(xì)胞。由此可見，與ctrl組相比，DC的相關(guān)免疫功能亦受到顯著抑制。降低胰腺癌細(xì)胞CXCL5的過度表達能夠顯著減輕腫瘤對DC的抑制作用。Michielsen等[24]在結(jié)直腸癌的研究中也得出了相似的結(jié)果。上述結(jié)果表明，胰腺癌細(xì)胞可能通過分泌大量CXCL5因子并釋放致微環(huán)境中，進而抑制DC的免疫功能，以達到免疫逃逸的目的，并最終導(dǎo)致患者的預(yù)后不佳。

有研究表明，Smad4蛋白在經(jīng)典骨形成蛋白(BMP)信號通路和基因調(diào)控中起樞紐作用，Smad-BMP信號通路能夠促進DC成熟，增強其免疫功能[25-27]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，BxCM能夠通過下調(diào)DC內(nèi)smad4蛋白的表達，進而抑制DC的成熟及免疫功能[10]。綜合本次實驗結(jié)果，我們推測，胰腺癌細(xì)胞有可能通過分泌CXCL5使DC內(nèi) Smad-BMP信號通路失活，致使DC的成熟及免疫功能受損，但這一推斷有待后續(xù)實驗的進一步驗證。

本研究也存在諸多不足之處，例如收集的臨床樣本量較少，需要更多細(xì)胞系及動物實驗的進一步驗證，是否還有其他因子參與胰腺癌微環(huán)境對DC的抑制，均需更深入的研究。

綜上所述，CXCL5在人胰腺癌組織和細(xì)胞上清液中異常高表達，與腫瘤TNM分期、血管侵犯以及不良預(yù)后有關(guān)；下調(diào)CXCL5表達能夠改善腫瘤微環(huán)境對DC免疫功能的抑制。本研究可能為將來胰腺癌的免疫治療提供新的預(yù)測指標(biāo)和治療靶點，以期待改善患者的預(yù)后。