武 康，汪家權(quán)，趙冰冰，方 艷，張發(fā)宇

1. 合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230009 2. 合肥工業(yè)大學(xué)土木與水利工程學(xué)院，安徽 合肥 230009 3. 合肥工業(yè)大學(xué)電子科學(xué)與應(yīng)用物理學(xué)院，安徽 合肥 230009

引 言

近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，河流湖泊的富營(yíng)養(yǎng)化程度愈發(fā)嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為夏季藍(lán)藻大規(guī)模爆發(fā)，政府要花大量資金打撈藍(lán)藻，如何實(shí)現(xiàn)藍(lán)藻減量化、資源化和無害化是亟待解決的重要問題之一。 目前的解決方案是把藍(lán)藻作為反應(yīng)物消化掉，如好氧堆肥、產(chǎn)沼氣、制備藍(lán)藻基活性炭、生產(chǎn)生物塑料制品等。 這些方法雖在一定程度上緩解了藍(lán)藻的處置難題，但存在被動(dòng)消化、附加值不高、經(jīng)濟(jì)效益低等問題。

巢湖藍(lán)藻體內(nèi)有豐富的藻膽蛋白，高純度的藻膽蛋白具有良好的抗衰老性、抗癌性和熒光免疫性等[1]。 提取與純化高純度藻膽蛋白既能實(shí)現(xiàn)主動(dòng)消化、高附加值資源化的目的，又可以推動(dòng)進(jìn)一步對(duì)藻膽蛋白特性的研究[2]。 紫外-可見吸收光譜法已被證明可以在提取純化藻膽蛋白過程中發(fā)揮重要作用。 這是由于藻膽蛋白(藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白)在紫外-可見波段(200～700 nm)除了具有一般的蛋白吸收峰(280 nm)外，還各自具有其相應(yīng)的最大特征吸收峰[3]。 如藻紅蛋白在565 nm有強(qiáng)吸收峰，藻藍(lán)蛋白在620 nm有強(qiáng)吸收峰，別藻藍(lán)蛋白在650 nm有強(qiáng)吸收峰。 通過對(duì)比測(cè)試樣品的吸收峰強(qiáng)度及位置變化，即可定性定量比較測(cè)試樣品的各組分濃度差異。 紫外-可見吸收光譜法成為藻膽蛋白提取純化過程中評(píng)價(jià)提取純化效果強(qiáng)有力的表征手段。 本研究以巢湖新鮮藍(lán)藻為實(shí)驗(yàn)原料，以CellufineA-500與羥基磷灰石為柱層析填料，結(jié)合兩種填料對(duì)應(yīng)的洗脫峰在洗脫曲線上的特點(diǎn)，在前人研究的基礎(chǔ)上，充分利用藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白與一般蛋白質(zhì)的紫外-可見光譜特性的差別，研判洗脫峰組分的動(dòng)態(tài)變化。 通過研究進(jìn)一步掌握收集高純度藻膽蛋白的時(shí)機(jī)，深入揭示了兩種柱層析填料純化藻膽蛋白的機(jī)理，為藍(lán)藻高附加值資源化提供一定的理論支撐。 目前提取新鮮藍(lán)藻的生物質(zhì)及相應(yīng)理論的研究尚屬稀缺，因此開展的對(duì)藻膽蛋白純化實(shí)驗(yàn)的光譜學(xué)分析將會(huì)為今后多維度深層次綜合利用藍(lán)藻以及研究其他提取生物質(zhì)實(shí)驗(yàn)的理論提供一定的思路和參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品采集

巢湖新鮮藻泥，采自于合肥市巢湖西湖區(qū)水體距表層15 cm處。 直接打撈，經(jīng)四層紗布過濾除去部分水分后，帶回實(shí)驗(yàn)室-18 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

紫外-可見分光光度計(jì)(TU-1950)，北京普析通用公司； 高速冷凍離心機(jī)(KDC-160HR)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司； 電子天平(FA2004N)，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司； 恒溫磁力攪拌器(85-2A)，江蘇金城國(guó)勝儀器廠。

常用試劑： 磷酸鹽緩沖試劑(PBS)，NaCl，NaOH，鹽酸，(NH4)2SO4(以上試劑均為分析純)； CellufineA-500，GE公司； 羥基磷灰石(CHT-B)，Biocanal公司。

1.3 工藝流程

藍(lán)藻藻泥→反復(fù)凍融提取→過濾→離心分離制備粗提液→一步鹽析→離心收集上清液→二步鹽析→透析脫鹽→柱層析(CellufineA-500，羥基磷灰石)分離純化→收集洗脫組分→紫外-可見吸收光譜法分析。

1.4 表征方法

根據(jù)藻膽蛋白的紫外-可見吸收特性，使用紫外-可見吸收光譜法表征提取純化藻膽蛋白過程中物質(zhì)含量相應(yīng)變化。 藻膽蛋白在紫外-可見波段(200～700 nm)除了具有一般的蛋白吸收峰(280 nm)外，還各自具有相應(yīng)的最大特征吸收峰。 對(duì)洗脫曲線在不同洗脫峰下根據(jù)峰的強(qiáng)度、面積大小選擇相應(yīng)的取樣點(diǎn)，對(duì)取樣點(diǎn)對(duì)應(yīng)的各溶液進(jìn)行200～700 nm全波長(zhǎng)掃描，得到各洗脫峰的光譜掃描變化圖，以此表征分析各組分隨著時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 CellufineA-500分離藻膽蛋白的紫外-可見光譜分析

圖1為使用CellufineA-500作為柱層析填料，用以分離藻膽蛋白的典型洗脫峰的信號(hào)圖。 在加入緩沖液之后，會(huì)分別出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的洗脫峰。 根據(jù)不同洗脫峰的強(qiáng)度、面積大小選擇相應(yīng)的取樣點(diǎn)。 將取樣點(diǎn)相應(yīng)的各溶液稀釋后進(jìn)行200 nm～700 nm全波長(zhǎng)掃描。 由于取樣點(diǎn)按照時(shí)間節(jié)點(diǎn)有序排列，故得到各洗脫峰的光譜掃描變化圖，以此分析各洗脫峰的組分及其含量動(dòng)態(tài)變化，如圖2所示。

圖1 Cellufine A-500分離藻膽蛋白的典型洗脫峰圖

2.1.1 洗脫峰Ⅰ的紫外-可見光譜圖變化分析

圖2(a)為圖1中Peak 1中所選取的取樣點(diǎn)進(jìn)行200～700 nm全波長(zhǎng)掃描后所繪制的光譜圖。 如圖中所示，取樣點(diǎn)A，B和C在280及414 nm均有吸收峰，這表明Peak 1所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為雜蛋白及類胡蘿卜素[4]，且雜蛋白的濃度較高。 由于CellufineA-500是陰離子交換填料，Buffer 1為平衡緩沖液，故洗脫下來的雜蛋白和類胡蘿卜素與填料不發(fā)生吸附作用，應(yīng)為陽離子或者電中性分子。 類胡蘿卜素的吸收峰為414 nm，則表明類胡蘿卜素的主要成分為鏈孢紅素。 類胡蘿卜素積累的前提之一是高強(qiáng)度的光線，對(duì)應(yīng)著夏季巢湖藍(lán)藻的大量爆發(fā)。 此外，圖2(a)中濃度關(guān)系為： B>A>C，對(duì)應(yīng)著圖1中Peak 1取樣點(diǎn)B的峰值。

2.1.2 洗脫峰Ⅱ的紫外-可見光譜圖變化分析

圖2(b)為圖1中Peak 2中所選取的取樣點(diǎn)進(jìn)行200～700 nm全波長(zhǎng)掃描后所繪制的光譜圖。 如圖中所示，取樣點(diǎn)A，B和C除了在268 nm有最大吸收峰外，在540及565 nm均有強(qiáng)吸收峰，這表明Peak 2所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為藻紅蛋白[5]、雜蛋白及部分核酸； 且由于核酸的存在，最大吸收峰波長(zhǎng)由280 nm藍(lán)移至268 nm處。 藻紅蛋白濃度不高且難以大量富集，提取純化價(jià)值不大，應(yīng)考慮作為雜蛋白去除。 Buffer 2為添加低濃度鹽的緩沖液，這表明此時(shí)去除的物質(zhì)與填料發(fā)生弱吸附作用，應(yīng)為帶少量負(fù)電荷的物質(zhì)，如核酸、藻紅蛋白等，這也表明藻紅蛋白的等電點(diǎn)高于藻藍(lán)蛋白。 對(duì)比A，B和C三點(diǎn)變化趨勢(shì)，可看出268 nm處的峰強(qiáng)度降低后，導(dǎo)致565 nm處的峰強(qiáng)度超過268 nm處，藻紅蛋白的純度略有上升，這表明核酸比藻紅蛋白優(yōu)先被去除。

2.1.3 洗脫峰Ⅲ的紫外-可見光譜圖變化分析

圖2(c)為圖1中Peak 3中所選取的取樣點(diǎn)進(jìn)行200～700 nm全波長(zhǎng)掃描后所繪制的光譜圖。 如圖中所示，取樣點(diǎn)A，B，C，D和E除了在277 nm有強(qiáng)吸收峰外，在620 nm有最大吸收峰以及358 nm有副吸收峰，與圖3中藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)光譜圖中典型的最大吸收峰(620 nm處)和蛋白質(zhì)吸收峰(277 nm處)一致，表明Peak3所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為高純度藻藍(lán)蛋白； 對(duì)比A，B，C，D和E取樣點(diǎn)的變化趨勢(shì)，可看出620 nm處的峰強(qiáng)度先上升然后保持穩(wěn)定最后下降，這表明藻藍(lán)蛋白的濃度先上升后下降，且在C點(diǎn)處達(dá)到最大。 B，C和D點(diǎn)藻藍(lán)蛋白純度均超過4.0，這表明B點(diǎn)到D點(diǎn)為高純度藻藍(lán)蛋白的最佳收集段； 但B點(diǎn)純度最高，達(dá)到4.26，與濃度變化略有不同。 為了探究其中緣由，在Peak 3出峰時(shí)間(43～53 min)間隔半分鐘測(cè)藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白相對(duì)含量，如圖4所示。

圖2 各洗脫峰取樣點(diǎn)的紫外-可見吸收光譜變化圖

圖4中藻藍(lán)蛋白的相對(duì)含量先上升后下降，最高達(dá)到95.2%，且相對(duì)集中分布于前半段，這表明藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白未能完全分離，從而制約了藻藍(lán)蛋白純度的進(jìn)一步提高。 由于Buffer 3的離子強(qiáng)度進(jìn)一步提升，非吸附作用特別強(qiáng)的組分均會(huì)被洗脫下來，故藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白應(yīng)帶有較多負(fù)電荷，且數(shù)量接近。 由于藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白的濃度比約為2∶1, 故藻藍(lán)蛋白會(huì)相對(duì)集中的被分離出，但不能完全排除別藻藍(lán)蛋白的干擾。

圖3 藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)光譜圖

圖4 Ⅲ峰藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白相對(duì)含量變化圖

2.1.4 洗脫峰Ⅳ的紫外-可見光譜圖變化分析

圖2(d)為圖1中Peak 4中所選取的取樣點(diǎn)進(jìn)行200～700 nm全波長(zhǎng)掃描后所繪制的光譜掃描圖。 如圖中所示，取樣點(diǎn)A，B和C除了在276 nm有最大吸收峰外，還在615 nm有強(qiáng)吸收峰，這表明Peak4所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為雜蛋白及低純度藻藍(lán)蛋白。 由于Buffer 4的離子強(qiáng)度進(jìn)一步升高，吸附作用強(qiáng)的組分一般也會(huì)被洗脫下來，此時(shí)洗脫的組分應(yīng)帶有大量負(fù)電荷。 對(duì)比A，B和C取樣點(diǎn)的變化趨勢(shì)，可看出藻藍(lán)蛋白吸收峰波長(zhǎng)由620 nm藍(lán)移至615 nm處，而276 nm處吸收峰的強(qiáng)度增加。 這表明低純度藻藍(lán)蛋白先于雜蛋白被洗脫，這可能是由于這部分雜蛋白等電點(diǎn)更低、帶有更多負(fù)電荷所導(dǎo)致。

2.2 羥基磷灰石分離藻膽蛋白的紫外-可見光譜分析

圖5為使用羥基磷灰石作為柱層析填料，用以分離藻膽蛋白的典型洗脫峰的信號(hào)圖。 如圖5在加入緩沖液之后，會(huì)分別出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的洗脫峰。 根據(jù)不同洗脫峰的強(qiáng)度、面積大小選擇相應(yīng)的取樣點(diǎn)。 然后將取樣點(diǎn)相應(yīng)的各溶液稀釋后進(jìn)行200～700 nm全波長(zhǎng)掃描。 由于取樣點(diǎn)按照時(shí)間節(jié)點(diǎn)有序排列，故得到各洗脫峰的光譜掃描變化圖，以此分析各洗脫峰的組分及其含量動(dòng)態(tài)變化，如圖5所示。

圖5 羥基磷灰石分離藻膽蛋白的典型洗脫峰圖

2.2.1 洗脫峰Ⅰ的紫外-可見光譜圖變化分析

圖6(a)為圖5中Peak 1中所選取的取樣點(diǎn)進(jìn)行200～700 nm全波長(zhǎng)掃描光譜圖。 如圖中所示，取樣點(diǎn)A，B和C在260 nm(272 nm)處均有最大吸收峰，在414，540及565 nm均有吸收峰，表明Peak 1所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為雜蛋白、核酸、少量類胡蘿卜素和藻紅蛋白，且雜蛋白與核酸的含量較高。 由于羥基磷灰石是金屬螯合親和填料，Buffer 1為平衡緩沖液，故洗脫下來的雜蛋白、核酸、藻紅蛋白和類胡蘿卜素與填料不發(fā)生螯合反應(yīng)，應(yīng)為堿性蛋白質(zhì)或正離子。 此外，圖6(a)中B點(diǎn)260，540與565 nm峰的強(qiáng)度均高于A與C點(diǎn)，這表明在B點(diǎn)處藻紅蛋白與核酸濃度高于兩邊，對(duì)應(yīng)著圖5中Peak 1取樣點(diǎn)B峰值。

2.2.2 洗脫峰Ⅱ的紫外-可見光譜圖變化分析

圖6(b)為圖5中Peak 2中所選取的取樣點(diǎn)進(jìn)行200～700 nm全波長(zhǎng)掃描的光譜圖。 如圖中所示，取樣點(diǎn)A，B，C，D和E在620 nm(615 nm)處均有最大吸收峰，在278及358 nm均有吸收峰，與圖3中藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)譜圖中典型的最大吸收峰和蛋白質(zhì)吸收峰一致，這表明Peak 2所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為高純度藻藍(lán)蛋白。 由于Buffer 2增加了磷酸鹽緩沖液濃度，故會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地置換結(jié)合蛋白質(zhì)，使與鈣離子形成較弱配位鍵的組分發(fā)生解吸反應(yīng)。 因此，藻藍(lán)蛋白應(yīng)為酸性蛋白質(zhì)，與鈣離子可發(fā)生較弱的螯合反應(yīng)。 此外，圖6(b)中A和E兩點(diǎn)最大吸收峰為615 nm處，這可能是由于A和E兩點(diǎn)尚存在少量雜蛋白； 隨著純度的增加，最大吸收峰逐漸紅移至620 nm處。 到C點(diǎn)時(shí)純度最高，可達(dá)4.62，高于CellufineA-500柱純化的藻藍(lán)蛋白，為了探究其中緣由，在Peak 2出峰時(shí)間(44～55 min)間隔半分鐘測(cè)藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白相對(duì)含量，如圖7所示。

圖6 各洗脫峰取樣點(diǎn)的紫外-可見吸收光譜變化圖

圖7 Ⅱ峰藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白相對(duì)含量變化圖

圖7中藻藍(lán)蛋白的相對(duì)含量先上升后下降，最高達(dá)到100%，且于46～50 min內(nèi)均可以保持，表明這段時(shí)間內(nèi)藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白能夠完全分離，從而較大程度上提高了藻藍(lán)蛋白的純度。 分析認(rèn)為由于配位鍵的存在，使得金屬螯合親和色譜的特異性高于陰陽離子交換色譜，因此羥基磷灰石的純化分辨率大于CellufineA-500，故能完全分離藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白。

2.2.3 洗脫峰Ⅲ的紫外-可見光譜圖變化分析

圖6(c)為圖5中Peak 3中所選取的取樣點(diǎn)進(jìn)行200～700 nm全波長(zhǎng)掃描后所繪制的光譜圖。 如圖中所示，取樣點(diǎn)A，B和C在650與620 nm處有顯著吸收峰，在276 nm處有相應(yīng)蛋白吸收峰，與圖3中別藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)譜圖中典型的最大吸收峰(650 nm處)和蛋白質(zhì)吸收峰一致，這表明Peak 3所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為別藻藍(lán)蛋白與少量藻藍(lán)蛋白。 由于Buffer 3進(jìn)一步增加了磷酸鹽緩沖液濃度，故會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地置換結(jié)合蛋白質(zhì)，顯著降低柱容量，使與鈣離子形成較強(qiáng)配位鍵的組分也發(fā)生解吸反應(yīng)。 因此，別藻藍(lán)蛋白應(yīng)為酸性蛋白質(zhì)，與鈣離子可發(fā)生較強(qiáng)的螯合反應(yīng)，配位鍵強(qiáng)度大于藻藍(lán)蛋白與鈣離子生成的配位鍵。 此外，圖6中A和C兩點(diǎn)在620 nm處均有強(qiáng)吸收峰，而非B點(diǎn)處的副吸收峰，這可能是由于藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白的濃度比約為2∶1，故A和C處兩點(diǎn)尚存在少量藻藍(lán)蛋白，使得在620 nm處的吸收峰強(qiáng)度增加； 隨著純度的增加，620 nm處的吸收峰強(qiáng)度逐漸下降，而650 nm處的吸收峰強(qiáng)度逐漸上升。 到B點(diǎn)時(shí)純度最高，可達(dá)4.33，而CellufineA-500卻無法達(dá)到這種分離效果，這是由于二者純化機(jī)理不同所導(dǎo)致的。

3 結(jié) 論

CellufineA-500填料能夠有效地將藻紅蛋白、核酸、類胡蘿卜素與雜蛋白從藻膽蛋白初步純化液中去除，最終獲得純度為4.2的試劑級(jí)藻藍(lán)蛋白，但不能完全分離藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白； 羥基磷灰石填料不僅能夠有效地將藻紅蛋白、核酸、類胡蘿卜素與雜蛋白從藻膽蛋白初步純化液中去除，還能夠有效分離藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白，同時(shí)獲得試劑級(jí)藻藍(lán)蛋白和試劑級(jí)別藻藍(lán)蛋白。

運(yùn)用紫外-可見吸收光譜變化圖逐一分析各洗脫峰，能夠有效鑒別各洗脫峰的組分和分離變化過程，動(dòng)態(tài)演繹了兩種柱層析填料分離雜質(zhì)、純化藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白的過程，闡明了兩種柱層析填料的作用機(jī)理。 本工作對(duì)藻膽蛋白純化實(shí)驗(yàn)的光譜學(xué)分析將會(huì)為今后多維度深層次綜合利用藍(lán)藻以及研究其他提取生物質(zhì)實(shí)驗(yàn)的理論提供一定的思路和參考。