馬紅燕，王靖原，張越誠，楊曉軍，陳小莉

延安大學化學與化工學院，延安市分析技術(shù)與檢測重點實驗室，陜西 延安 716000

引 言

多巴胺(Dopamine, DA)是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)之一，在心血管、腎、激素系統(tǒng)的功能中起著關(guān)鍵作用[1]，但異常的DA水平可能會引起一些腦部疾病[2]。 因此，DA的準確檢測對于神經(jīng)生理學、病理學及臨床疾病診斷等至關(guān)重要。 目前，DA的測定方法主要有HPLC法[3]、電化學法[4]、化學發(fā)光法[5]等。 熒光法由于其特有的高靈敏度等優(yōu)勢，在DA的測定中也得到了應用[6-7]，Chen等[6]設(shè)計了一種無機-有機網(wǎng)絡(luò)配合物為熒光探針，利用DA可使其熒光猝滅的特性檢測DA； Liu等[7]利用DA能猝滅MoS2量子點來進行DA的定量檢測，但該量子點中Mo為重金屬，限制了方法的廣泛應用。 文獻中未見將綠色發(fā)光CQDs設(shè)計為“關(guān)-開”型熒光探針測定DA的研究報道。

CQDs是粒徑大小一般在10 nm左右，其形狀近似為球形的一種新型熒光碳納米功能材料。 由于其易于制備、環(huán)境友好、光學性能顯著、光穩(wěn)定性好、細胞毒性低，被譽為熒光生物傳感、生物化學、藥物遞送和反應催化的新平臺[8]。 目前CQDs制備所用碳源基本為含碳化合物，過程復雜且對反應儀器要求較高。 近年來，一些利用天然生物質(zhì)為原料制備CQDs的方法相繼出現(xiàn)。 本文以天然物質(zhì)“花生”為原料，只加入水，無需添加其他試劑，利用一步水熱法可直接合成熒光強度高、水溶性和光穩(wěn)定性好、綠色無毒的花生碳量子點(PN-CQDs)，并基于Ce(Ⅳ)可以明顯的猝滅該PN-CQDs的熒光，加入DA后PN-CQDs的熒光可以恢復的現(xiàn)象，構(gòu)建了“關(guān)-開”型熒光探針用于DA的高靈敏檢測。 實驗對PN-CQDs熒光猝滅-恢復的機理進行了探討。 該研究為DA的檢測提供了新方法，同時也拓展了CQDs在藥物和分析化學領(lǐng)域的應用范圍。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

FLSP920瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(英國愛丁堡儀器有限公司)； F-4500熒光光度計(日本日立儀器公司)； IR Prestige-21傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津儀器公司)； HT7700透射電鏡(日本日立儀器公司)； 8453型紫外-可見分光光度計(美國安捷倫儀器有限公司)； XRD-7000 X射線粉末衍射儀(日本島津儀器公司)。

稱取DA標準品(中國藥品生物制品檢定所)0.019 0 g以水溶解后定容至100 mL，配成濃度為1.0×10-3mol·L-1的DA標準溶液，4 ℃保存待用。 實驗所用Ce(SO4)2溶液濃度為0.003 mol·L-1。 緩沖溶液為pH 3.80的HAc-NaAc。 實驗中所有化學試劑均AR級，花生仁購于當?shù)爻小?實驗用水為UP超純水。

1.2 方法

PN-CQDs的合成： 稱取8.0 g磨碎花生仁于50 mL聚四氟乙烯水熱反應釜中，加入30.0 mL水，攪拌均勻后置于真空干燥箱中，于190 ℃反應20 h，待冷卻至室溫后，經(jīng)濾紙過濾后用0.22 μm微濾膜再次過濾并定容于100 mL容量瓶中。 PN-CQDs工作液為原液稀釋200倍，備用。

在10 mL比色管中依次加入稀釋200倍的 PN-CQDs工作液2.00和3.00 mL HAc-NaAc緩沖溶液(pH 3.80)，Ce(SO4)2溶液0.80 mL，再加入不同濃度的DA溶液，定容。 于反應條件為80 ℃恒溫水浴中加熱10 min，流水冷卻5 min后，在PN-CQDs最佳激發(fā)λex=326 nm下測定體系的熒光強度，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。 當實驗中激發(fā)波長λex為251 nm時，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 CQDs的表征

通過透射電鏡對PN-CQDs進行了表征，結(jié)果如圖1(a)所示，所制得的PN-CQDs分散度較好，分布較為均勻，插圖為PN-CQDs的粒徑分布圖，由圖可知PN-CQDs的粒徑大約在10 nm左右。

圖1 PN-CQDs的TEM圖(a)、紫外-可見吸收光譜(b)、XRD圖(c)和紅外光譜圖(d)

對PN-CQDs溶液進行干燥處理，得到固態(tài)PN-CQDs，XRD表征結(jié)果如圖1(c)所示，其衍射峰為2θ=21.46°，該峰是碳無定形態(tài)特征峰，因此確定該PN-CQDs的晶型為無定型碳，這歸因于高度無序的碳顆粒[10]。

2.2 CQDs的熒光特性

探究了不同激發(fā)波長λex下PN-CQDs的熒光光譜，如圖2所示。 由圖可知，該PN-CQDs的發(fā)射波長λem和強度強烈依賴于λex。 隨著λex由296 nm增加到356 nm，λem由400 nm紅移至425 nm，熒光強度先增大后減小，其原因可能是PN-CQDs表面的缺陷、發(fā)射位點的數(shù)量和位置不同所致。 當λex為326 nm時，熒光強度達到最大，故實驗所選λex為326 nm。

根據(jù)文獻[11]以硫酸奎寧為參照物質(zhì)，利用參比法，計算得出PN-CQDs的熒光量子產(chǎn)率φ為5.0%。

圖2 不同激發(fā)波長下PN-CQDs的熒光光譜

2.3 Ce(Ⅳ)對PN-CQDs的猝滅作用

由圖3體系的熒光光譜圖可以看出，在PN-CQDs(曲線7)中加入Ce(Ⅳ)后，體系在λex/λem=326 nm/408 nm處的熒光強度降低(曲線1)，PN-CQDs的熒光信號發(fā)生明顯猝滅。 同時發(fā)現(xiàn)，體系在λex/λem=251 nm/350 nm處出現(xiàn)了新的熒光峰(曲線8)。 而Ce(Ⅲ)的特征激發(fā)波長為251 nm，特征發(fā)射波長為350 nm[12]，說明PN-CQDs與Ce(Ⅳ)之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移生成了強熒光性的Ce(Ⅲ)，PN-CQDs自身熒光信號“關(guān)閉”。

圖3 Ce(Ⅳ)和DA存在下體系的熒光光譜圖

λex=251 nm, 狹縫寬度均為2.5 nm； λex=326 nm, 狹縫寬度均為5 nm

注： 圖3中每條線的含義： 7： CQDs； 1和8： CQDs+Ce(Ⅳ)； 2—6和9—13： CQDs+Ce(Ⅳ)中分別加入1.0，2.5，5.0，7.5，10.0 μmol·L-1DA； (曲線1—7對應右側(cè)縱坐標值，曲線8—13對應左側(cè)縱坐標值

Fig.3FluorescencespectrumofthesysteminthepresenceofCe(Ⅳ)andDAλex=251 nm, EX/EM Slit 2.5 nm;λex=326 nm, EX/EM Slit 5 nm

Note: The meanings of each line in Fig.3 are: 7: CQDs; 1 and 8: CQDs+Ce(Ⅳ); 2—6 and 9—13: CQDs+Ce(Ⅳ) with 1.0, 2.5, 5.0, 7.5 and 10.0 μmol·L-1DA，respectively; (Curve 1—7 corresponds to the right ordinate value, curve 8—13 corresponds to the left ordinate value

實驗對PN-CQDs和PN-CQDs-Ce(Ⅳ)進行了熒光壽命的測定，結(jié)果如表1，其加權(quán)平均熒光壽命分別為6.02與5.15 ns，PN-CQDs-Ce(Ⅳ)與PN-CQDs體系相比，熒光壽命縮短，證實Ce(Ⅳ)使PN-CQDs熒光猝滅為動態(tài)猝滅[13]，即Ce(Ⅳ)與激發(fā)態(tài)的PN-CQDs之間發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移導致PN-CQDs熒光猝滅。

表1 PN-CQDs和PN-CQDs-Ce(Ⅳ)的熒光壽命值

注：τ為熒光壽命；χ2為卡方檢驗

2.4 多巴胺對PN-CQDs-Ce(Ⅳ)體系熒光的恢復

向上述PN-CQDs-Ce(Ⅳ)體系(曲線1)中加入不同濃度的DA，如圖3所示，λex/λem=326 nm/408 nm處和λex/λem=251 nm/350 nm的熒光峰均隨DA濃度的增加而有規(guī)律的增大，λex/λem=326 nm/408 nm處PN-CQDs熒光信號得以恢復。λex/λem=326 nm/408 nm為PN-CQDs的特征熒光峰，此處熒光信號的恢復表明，當Ce(Ⅳ)加入到PN-CQDs溶液后，PN-CQDs熒光信號的猝滅除了Ce(Ⅳ)與PN-CQDs之間直接的電子轉(zhuǎn)移作用外，還可能有部分Ce(Ⅳ)會與PN-CQDs的表面—OH和—COOH等基團進行結(jié)合[14]，使PN-CQDs發(fā)生聚集，從而也導致PN-CQDs熒光猝滅，使得PN-CQDs熒光信號“關(guān)閉”。 DA加入后，由于其強的還原性，更易與結(jié)合于PN-CQDs表面的Ce(Ⅳ)發(fā)生反應，將結(jié)合于PN-CQDs表面的Ce(Ⅳ)“去除”，PN-CQDs被不斷釋放出來，導致λex/λem=326 nm/408 nm處熒光信號增大，PN-CQDs的熒光信號“打開”； 同時，DA與表面移除下來的Ce(Ⅳ)反應生成Ce(Ⅲ)使λex/λem=251 nm/350 nm下的熒光信號也表現(xiàn)出了同步增強。

圖4 Ce(Ⅳ)-DA體系在不同λex下的熒光光譜圖

λex=251 nm, 狹縫寬度均為2.5 nm；λex=326 nm, 狹縫寬度均為5 nm

Fig.4FluorescencespectraofCe(Ⅳ)-DAsystemunderdifferentexcitation

λex=251 nm, EX/EM Slit 2.5 nm;λex=326 nm, EX/EM Slit 5 nm

為驗證上述推測，在一定量的Ce(Ⅳ)中加入不同濃度DA進行實驗，結(jié)果如圖4所示。 由圖可知，隨DA濃度增加，Ce(Ⅳ)與DA反應生成的Ce(Ⅲ)在λex/λem=251 nm/350 nm下熒光強度逐漸升高，但在λex/λem=326 nm/408 nm下幾乎沒有熒光，說明體系中反應生成的Ce(Ⅲ)對λex/λem=326 nm/408 nm下的熒光強度的測定不會造成影響。 根據(jù)λex/λem=326 nm/408 nm波長處熒光信號的恢復值可直接進行DA的測定。

綜上所述，當Ce(Ⅳ)加入到PN-CQDs溶液后，PN-CQDs與Ce(Ⅳ)之間的電子轉(zhuǎn)移反應(如圖5中的路線A)和Ce(Ⅳ)與PN-CQDs表面基團的結(jié)合作用(如圖5中的路線B)共同導致PN-CQDs熒光猝滅，DA能將結(jié)合于PN-CQDs表面的Ce(Ⅳ)“去除”，使PN-CQDs熒光恢復。 體系反應原理如圖5所示。

圖5 體系反應原理圖

2.5 多巴胺測定條件優(yōu)化

對測定DA時體系的酸度、緩沖溶液用量、猝滅劑Ce(SO4)2的用量、PN-CQDs的用量進行了優(yōu)化，結(jié)果如圖6。 圖6表明，加入3.00 mL pH 3.80的HAc-NaAc緩沖溶液、0.003 mol·L-1的Ce(SO4)2溶液0.80和2.00 mL PN-CQDs時，體系的熒光恢復值最大。

圖6 緩沖溶液pH值的選擇(a)； 緩沖溶液、Ce(SO4)2和PN-CQDs用量(b)對體系的影響

Fig.6ThepHvalueofthebuffersolution(a)；theeffectofbuffer,Ce(SO4)2andPN-CQDsdosage(b)onthesystem

實驗發(fā)現(xiàn)，反應在室溫下進行的比較緩慢，故實驗中采用水浴加熱來提高反應速率。 探究了不同的溫度下的加熱時間，如圖7所示，在80 ℃的恒溫水浴中加熱10 min，PN-CQDs熒光信號恢復程度ΔF可達最大，且在20 h內(nèi)基本不變。

2.6 干擾測定

在優(yōu)化的實驗條件下，DA濃度為1.0×10-5mol·L-1，考察了可能存在的離子和藥劑輔料對實驗的影響，結(jié)果如表2所示。

圖7 反應溫度(a)和時間(b)的影響

表2 干擾物質(zhì)對體系的影響Table 2 The influence of interfering substances on the system

2.7 方法分析性能

DA濃度在2.5×10-7～1.0×10-5mol·L-1的范圍內(nèi)與PN-CQDs-Ce(Ⅳ)體系熒光恢復值呈一定的線性關(guān)系。 圖8顯示其線性方程為ΔF=2.68×107c+16.68，決定系數(shù)R2為0.997 6。 方法相對標準偏差為1.3% (c=1.0×10-5mol·L-1，n=5)，檢出限低至9.0×10-8mol·L-1。

圖8 PN-CQDs-Ce(SO4)2-DA的線性回歸方程

2.8 樣品測定

取同一批次的DA 5支(規(guī)格： 10 mg·mL-1)，準確量取其體積1.9 mL(相當于DA 0.019 0 g)，用水定容于100 mL容量瓶中。 移取適量，按照實驗方法進行測定。 從表3中可以看出加標回收率(平均值±SD)在97.5%±1.3%～103%±1.5%之間。

表3 加標回收實驗(n=5)

注： 1為上海禾豐制藥有限公司，產(chǎn)品批號： 33160302； 2為上海禾豐制藥有限公司，產(chǎn)品批號： 33170812

3 結(jié) 論

采用一步水熱法合成了強熒光PN-CQDs。 基于DA可使被Ce(Ⅳ)猝滅的PN-CQDs熒光信號重新恢復的現(xiàn)象，實現(xiàn)了對DA的定量測定，該方法靈敏度高、操作簡單、綠色環(huán)保、成本低廉。 該研究拓展了CQDs在分析化學領(lǐng)域的應用范圍，為一些藥物的熒光檢測提供了新思路。