徐碧林，朱慶，陳巖巖，鄭永良

·生物技術(shù)與方法·

利用優(yōu)化的反向PCR策略高效構(gòu)建多位點(diǎn)突變體

徐碧林1，朱慶2，陳巖巖1，鄭永良1

1 黃岡師范學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)資源改良與綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北省大別山特色資源開(kāi)發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000 2 武漢市疾病預(yù)防與控制中心，湖北 武漢 430015

蛋白質(zhì)的突變體是研究其結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)，文中旨在建立一種高效、快捷的多位點(diǎn)突變體構(gòu)建方法。當(dāng)要突變4個(gè)及以上相鄰的氨基酸殘基時(shí)，設(shè)計(jì)兩長(zhǎng)兩短 (長(zhǎng)引物Ⅰ/Ⅲ、短引物Ⅱ/Ⅳ) 4條引物：長(zhǎng)引物包含突變位點(diǎn)，且突變堿基數(shù)≤20 bp，短引物不包含突變位點(diǎn)；兩條引物的GC含量≤80%、退火溫度之差≤40 ℃，分別以Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ兩對(duì)引物和模板進(jìn)行兩組反向PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后各體系均可得到含有突變位點(diǎn)的非甲基化線性質(zhì)粒，且以Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ為引物擴(kuò)增得到的兩組線性質(zhì)粒的斷開(kāi)位點(diǎn)分布在突變位點(diǎn)兩側(cè)。用Ⅰ酶切回收后等摩爾比混合的PCR產(chǎn)物除去甲基化模板，再進(jìn)行一輪變性和退火處理，兩組線性質(zhì)粒在95 ℃變性后互相以來(lái)自對(duì)方的單鏈DNA為模板退火形成開(kāi)環(huán)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞即可得到包含突變位點(diǎn)的轉(zhuǎn)化子。結(jié)果表明，該方法可同時(shí)突變4–11個(gè)連續(xù)氨基酸殘基 (8–20 bp，將大幅簡(jiǎn)化多位點(diǎn)突變體的構(gòu)建，從而進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究的效率。

引物，反向PCR，定點(diǎn)突變，多位點(diǎn)突變體

構(gòu)建突變體是設(shè)計(jì)生物醫(yī)學(xué)/生物技術(shù)具有預(yù)期性能的新物質(zhì)[1]和研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的主要策略之一，例如，研究酶的穩(wěn)定性和活性[2-3]蛋白質(zhì)相互作用[4]、蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)的確定[5-8]、蛋白質(zhì)和DNA相互作用[9]以及酶的加工成熟方式[10]等。目前常用的引入突變的方法大體可分為兩類(lèi)：以常規(guī)PCR[11]、重疊PCR[12-15]、大引物PCR[16-18]和反向PCR[19]為主的重組PCR技術(shù)[20]以及Stratagene公司基于反向PCR原理開(kāi)發(fā)的點(diǎn)突變?cè)噭?QuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis System (QCM))[21]。其中重組PCR方法能構(gòu)建點(diǎn)突變、插入和缺失等多種突變體，但是具體操作起來(lái)比較繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，而且多步操作還會(huì)降低克隆的陽(yáng)性率：尤其是重疊PCR和大引物PCR，第一輪PCR結(jié)束后必須進(jìn)行膠回收得目的片段用于第二輪PCR，另外第二輪PCR結(jié)束后需要再回收、酶切、與酶切后的載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑克隆進(jìn)行PCR和酶切鑒定。QCM利用突變引物進(jìn)行一輪反向PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Ⅰ酶切除去甲基化和半甲基化的模板后，再進(jìn)行轉(zhuǎn)化就可以在24 h內(nèi)得到陽(yáng)性率高達(dá)70%–90%的轉(zhuǎn)化子。然而，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該方法可以高效構(gòu)建3個(gè)及以下相鄰氨基酸殘基突變的突變體，較難構(gòu)建4個(gè)及以上相鄰氨基酸殘基突變的突變體。為此，基于反向PCR原理，本研究設(shè)計(jì)了一個(gè)可高效、快捷地構(gòu)建多位點(diǎn)突變體的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

菌種DH5α和質(zhì)粒pET26b、pUC18- Lip-SBRN2均保存于黃岡師范學(xué)院經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)資源改良與綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑

酵母提取物(Yeast extract) 和蛋白胨(Tryptone) 購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，瓊脂粉購(gòu)于BioSharp公司。氯化鈉(NaCl) 和卡那霉素購(gòu)自上海申試化工。FastDNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司(TransGen Biotech.)。限制性內(nèi)切酶Ⅰ購(gòu)于賽默飛世爾(Thermo scientific)。λ-dⅢ digest DNA Marker購(gòu)于TaKaRa公司。Cycle-pure PCR產(chǎn)物回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-tek公司。瓊脂糖：分析純，購(gòu)自西班牙Biowest公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pET26b-Lip-SBRN2的構(gòu)建

以包含編碼嗜熱脂肪酶Lip-SBRN2基因的質(zhì)粒pUC18-Lip-SBRN2為模板，上游引物pET26b-Lip-SBRN2-F：5′-ATTAATTCGA TGCTGTCTGTTGTG-3′，下游引物pET26b-Lip- SBRN2-R：5′-GTGGTGGTGTTATTTCC CGCT-3′ (下劃線標(biāo)明的序列為酶切位點(diǎn)，正向引物的酶切位點(diǎn)為HⅠ，反向引物的酶切位點(diǎn)為Ⅰ)。總體積50 μL反應(yīng)體系含有20 ng模板質(zhì)粒、各10 pmol上下游引物、10 nmol/L dNTPs、2.5 U FastDNA聚合酶、10 μL 5×Fast緩沖液和10 μL 5×PCR刺激劑。按照反應(yīng)程序 (95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s；55 ℃退火1 min；72 ℃延伸30 s，從變性到延伸共30個(gè)循環(huán)，72 ℃保溫5 min后12 ℃保溫) 進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到Lip-SBRN2基因片段。用HⅠ和Ⅰ酶切大腸桿菌表達(dá)載體pET26b及回收的PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物回收后連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取3個(gè)轉(zhuǎn)化子于5 mL LB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)12 h后，提質(zhì)粒酶切檢測(cè)，挑取酶切正確的質(zhì)粒利用T7通用引物進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.2 多位點(diǎn)突變體ZQ1~ZQ7引物設(shè)計(jì)

為探究嗜熱脂肪酶Lip-SBRN2 (GenBank: EF584562.1) 的溫度適應(yīng)機(jī)制，將其成熟酶區(qū)與高度同源的嗜溫脂肪酶Lip A (UniProtKB: P37957 )非保守氨基酸殘基替換為L(zhǎng)ip A對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸殘基，突變策略如圖1所示，其中ZQ1–ZQ7為本研究重點(diǎn)闡述的突變體，它們包含的突變位點(diǎn)如表1所示。結(jié)合優(yōu)化的反向PCR策略，遵循以下原則設(shè)計(jì)引物：1) 如圖2A所示，每構(gòu)建一個(gè)多位點(diǎn)突變體需要設(shè)計(jì)4條引物：兩條長(zhǎng)引物(Ⅱ/Ⅲ) 和兩條短引物(Ⅰ/Ⅳ)，其中長(zhǎng)引物包含突變位點(diǎn)，短引物不包含突變位點(diǎn)，長(zhǎng)短引物分別與質(zhì)粒模板的兩條鏈互補(bǔ)，二者5′端可以交錯(cuò)重疊也可不重疊(圖2B和2C)；2) 根據(jù)突變氨基酸殘基數(shù)目的差異，包含突變位點(diǎn)的長(zhǎng)引物3′端延伸區(qū)最少需要包含與突變的氨基酸殘基數(shù)目相匹配的且與模板完全互補(bǔ)的堿基；3) 引物的3′端應(yīng)包含至少一個(gè)G或C堿基，盡量避免3個(gè)以上的重復(fù)堿基，以免錯(cuò)配；4) 兩條引物GC含量最好都控制在80%以內(nèi)；5) 同一組反向PCR內(nèi)，兩條引物(如Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ) 退火溫度差 ≤40 ℃；6) 短引物一般長(zhǎng)約15–18 bp，如果需要突變的氨基酸殘基較多，可根據(jù)長(zhǎng)短引物退火溫度差≤40 ℃來(lái)調(diào)節(jié)短引物的長(zhǎng)度；7) 使用經(jīng)過(guò)PAGE或HPLC純化的引物，否則會(huì)降低突變陽(yáng)性率。

圖1 Lip-SBRN2 (GenBank: EF584562)和Lip A (UniProtKB: P37957)成熟酶氨基酸序列比對(duì)

表1 多位點(diǎn)突變體ZQ1–ZQ7包含的突變位點(diǎn)

圖2 多位點(diǎn)突變體引物設(shè)計(jì)策略示意圖

1.2.3 多位點(diǎn)突變體ZQ1–ZQ7的構(gòu)建

以包含編碼嗜熱脂肪酶Lip-SBRN2基因的質(zhì)粒pET26b-Lip-SBRN2為模板，高保真聚合酶FastDNA聚合酶以及表1中的引物進(jìn)行反向PCR。構(gòu)建每一個(gè)多位點(diǎn)突變體分別包含兩組反向PCR反應(yīng)(分別以引物對(duì)ZQ(1–7)-a-F/R和ZQ(1–7)-b-F/R進(jìn)行兩組PCR)，總體積50 μL反應(yīng)體系含有20 ng模板質(zhì)粒、各10 pmol上下游引物、10 nmol/L dNTPs、2.5 U FastDNA聚合酶、10 μL 5×Fast緩沖液和10 μL 5×PCR刺激劑。按照反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性 20 s；ZQ1-a：44 ℃、ZQ1-b：32 ℃，ZQ2-a：48 ℃、ZQ2-b：48 ℃，ZQ3-a：54 ℃、ZQ3-b：55 ℃，ZQ4-a：50 ℃、ZQ4-b：38 ℃，ZQ5-a：40 ℃、ZQ5-b：42 ℃，ZQ6-a：40 ℃、ZQ6-b：47 ℃，ZQ7-a：45 ℃、ZQ7-b：55 ℃，退火1 min；72 ℃延伸2 min 30 s，從變性到延伸共30個(gè)循環(huán)，72 ℃保溫5 min后12 ℃保溫，進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到含有突變位點(diǎn)的線性質(zhì)粒。

反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)目的條帶，限制性內(nèi)切酶Ⅰ酶切回收產(chǎn)物，除去甲基化和半甲基化模板；將每一個(gè)多位點(diǎn)突變體的兩組酶切產(chǎn)物(ZQ(1–7)-a和ZQ(1–7)-b) 等摩爾比混合，按照95 ℃變性10 min、60 ℃退火30 min、然后12 ℃保溫的程序進(jìn)行處理后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有終濃度為30 μg/mL 卡那霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。在每一個(gè)平板上隨機(jī)挑取3個(gè)轉(zhuǎn)化子于5 mL LB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)12 h后，提質(zhì)粒酶切檢測(cè)，挑取酶切正確的質(zhì)粒利用T7通用引物進(jìn)行測(cè)序 鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET26b-Lip-SBRN2的構(gòu)建

以pUC18-Lip-SBRN2為模板，及針對(duì)脂肪酶Lip-SBRN2編碼區(qū)的引物pET26b-Lip-SBRN2--F和pET26b-Lip-SBRN2-R，擴(kuò)增得到了特異性的長(zhǎng)度為588 bp的目的條帶(圖3A)，與載體pET26b同時(shí)經(jīng)HⅠ和Ⅰ酶切、回收、連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、挑取轉(zhuǎn)化子測(cè)序鑒定之后，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET26b- Lip-SBRN2 (圖3B)。

圖3 pET26b-Lip-SBRN2構(gòu)建過(guò)程中酶切片段瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 多位點(diǎn)突變體ZQ1–ZQ7引物設(shè)計(jì)

根據(jù)脂肪酶Lip-SBRN2 (GenBank: EF584562.1)和Lip A(UniProtKB: P37957)的DNA和氨基酸序列，結(jié)合優(yōu)化的反向PCR策略，以及上述引物設(shè)計(jì)的原則，成功設(shè)計(jì)多位點(diǎn)突變體ZQ1–ZQ7的引物如表2所示。其中各突變體包含的突變堿基數(shù)和長(zhǎng)引物3′端與模板完全互補(bǔ)的堿基數(shù)以及短引物的堿基數(shù)總結(jié)如表3所示。

2.3 多位點(diǎn)突變體ZQ1–ZQ7的構(gòu)建

以重組質(zhì)粒pET26b-Lip-SBRN2為模板，以及針對(duì)全長(zhǎng)質(zhì)粒且含有突變位點(diǎn)的引物ZQ(1–7)- a-F/R和ZQ(1–7)-b-F/R，分別進(jìn)行兩輪反向PCR，擴(kuò)增得到了特異性的長(zhǎng)度約為5 900 bp的目的條帶(圖4A)。經(jīng)過(guò)回收、Ⅰ酶切及二輪變性退火處理后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、挑取轉(zhuǎn)化子測(cè)序鑒定之后，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒ZQ1–ZQ7 (圖4B)。

2.4 優(yōu)化的反向PCR策略

根據(jù)2.2所述原則設(shè)計(jì)的引物，利用上述PCR體系和程序，我們成功構(gòu)建了多位點(diǎn)突變體ZQ1–ZQ7，該結(jié)果表明優(yōu)化的反向PCR策略可以高效構(gòu)建多位點(diǎn)突變體。現(xiàn)將該P(yáng)CR策略的原理展示如圖5所示。設(shè)計(jì)合成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四條引物，分別以Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ兩對(duì)引物和模板進(jìn)行兩組反向PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)質(zhì)粒。一輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，可得到一條鏈含有突變位點(diǎn)的半甲基化非正常質(zhì)粒；第二輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，以含有突變位點(diǎn)的那一條鏈為模板擴(kuò)增時(shí)，可得到雙鏈都含有突變位點(diǎn)的無(wú)甲基化非正常質(zhì)粒；第三輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，以雙鏈都含有突變位點(diǎn)的非正常質(zhì)粒為模板擴(kuò)增時(shí)，可得到含有突變位點(diǎn)的非甲基化的線性質(zhì)粒，且以Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ為引物擴(kuò)增得到的兩組線性質(zhì)粒的斷開(kāi)位點(diǎn)分布在突變位點(diǎn)兩側(cè)。經(jīng)過(guò)多輪反向PCR擴(kuò)增后，體系中可積累大量的含有突變位點(diǎn)的非甲基化線性質(zhì)粒。將這兩組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別回收后用限制性內(nèi)切酶Ⅰ酶切去掉甲基化和半甲基化的模板，等摩爾比混合后按照95 ℃變性10 min、60 ℃退火30 min、然后12 ℃保溫的程序進(jìn)行處理，兩條線性質(zhì)粒在95 ℃變性后互相以來(lái)自對(duì)方的單鏈DNA為模板退火形成開(kāi)環(huán)質(zhì)粒，將處理后的開(kāi)環(huán)質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后可環(huán)化為可存活的質(zhì)粒，挑轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定即可得到陽(yáng)性克隆。

表2 多位點(diǎn)突變體ZQ1–ZQ7的引物序列*

* The boxed bold bases are mutant bases.

表3 各突變體包含的突變堿基數(shù)及引物與模板互補(bǔ)的堿基數(shù)

圖4 多位點(diǎn)突變體ZQ1–ZQ7 PCR結(jié)果及重組質(zhì)粒凝膠電泳檢測(cè)圖

3 討論

本研究基于反向PCR原理，通過(guò)設(shè)計(jì)兩對(duì)一長(zhǎng)一短的引物(長(zhǎng)引物包含突變位點(diǎn)，短引物不包含突變位點(diǎn)，長(zhǎng)短引物分別與質(zhì)粒模板的兩條鏈互補(bǔ))，取一長(zhǎng)一短兩條引物同時(shí)進(jìn)行兩輪反向PCR擴(kuò)增得到包含突變位點(diǎn)的線性質(zhì)粒，用Ⅰ酶切擴(kuò)增產(chǎn)物降解甲基化模板后等摩爾比混合，再進(jìn)行一輪變性和退火處理并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，即可在24 h內(nèi)得到包含多位點(diǎn)突變的轉(zhuǎn)化子。

由Stratagene公司基于反向PCR原理開(kāi)發(fā)的點(diǎn)突變?cè)噭┖蠶CM，通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)包含突變位點(diǎn)的互補(bǔ)引物，進(jìn)行一輪反向PCR反應(yīng)擴(kuò)增全長(zhǎng)質(zhì)粒就可以在DNA序列中引入突變，用Ⅰ酶切擴(kuò)增產(chǎn)物降解甲基化模板后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在24 h內(nèi)即可得到突變體陽(yáng)性率約為70%–90%的轉(zhuǎn)化子[21]。反向PCR方法和QCM技術(shù)可以快速構(gòu)建突變3個(gè)及以下氨基酸殘基的突變體，對(duì)于突變多于4個(gè)及以上氨基酸殘基的突變體陽(yáng)性率則急劇降低[21-22]。而本研究提供的優(yōu)化反向PCR策略可以成功構(gòu)建4–11個(gè)相鄰氨基酸殘基突變的多位點(diǎn)突變體。

圖5 優(yōu)化的反向PCR策略原理圖

對(duì)于多位點(diǎn)突變體的構(gòu)建，Wang等曾基于QCM技術(shù)，通過(guò)兩步共三輪PCR反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了多位點(diǎn)突變、插入和缺失，該方法的陽(yáng)性突變率也高達(dá)70%–90%，但是多輪PCR反應(yīng)耗時(shí)更長(zhǎng)且相對(duì)較繁瑣[23]。Cabré也曾基于QCM技術(shù)，利用完全反向互補(bǔ)且包含突變位點(diǎn)的一對(duì)長(zhǎng)引物實(shí)現(xiàn)了8個(gè)相鄰堿基突變體的構(gòu)建[24]，對(duì)于相鄰堿基突變，該方法具有較強(qiáng)的可操作性，但是對(duì)于不相鄰的多堿基突變，該方法的效果可能有待進(jìn)一步檢測(cè)。相對(duì)于Wang等的多輪PCR擴(kuò)增，本研究只需要同步的兩組反向PCR擴(kuò)增即可構(gòu)建多位點(diǎn)突變，大大提高了構(gòu)建克隆的效率。此外，本研究提供的方法可以實(shí)現(xiàn)8–20 bp堿基突變，其中包含7個(gè)相鄰堿基突變，相對(duì)于Cabré等8個(gè)相鄰堿基的突變具有更廣泛適用性。綜上所述，本研究提供的優(yōu)化反向PCR策略高效、快捷地實(shí)現(xiàn)了多位點(diǎn)突變體的構(gòu)建。但是利用該方法進(jìn)行多位點(diǎn)缺失和插入突變的效果還有待進(jìn)一步研究，且該方法構(gòu)建突變體過(guò)程中出現(xiàn)的包含一條多余的擴(kuò)增引物的假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的形成原因也有待進(jìn)一步深入探究。

4 結(jié)論

通過(guò)優(yōu)化引物設(shè)計(jì)，利用兩長(zhǎng)兩短(長(zhǎng)引物包含突變位點(diǎn)，短引物不包含突變位點(diǎn)，長(zhǎng)短引物分別與模板質(zhì)粒的兩條鏈互補(bǔ)) 4條引物同時(shí)進(jìn)行兩組反向PCR擴(kuò)增，以及一輪變性、退火處理，成功高效快捷(24 h內(nèi)即可得到轉(zhuǎn)化子) 地實(shí)現(xiàn)了4–11個(gè)氨基酸殘基突變(8–20 bp) 的突變體構(gòu)建。該方法為生物醫(yī)藥和生物技術(shù)設(shè)計(jì)新的化合物及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Optimized inverse PCR strategy for constructing multilocus mutants efficiently

Bilin Xu1, Qing Zhu2, Yanyan Chen1, and Yongliang Zheng1

1 Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization, Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains, College of Biological and Agricultural Resources, Huanggang Normal University, Huanggang 438000, Hubei, China 2 Wuhan Center for Disease Control and Prevention, Wuhan 430015, Hubei,China

Mutants of proteins are the basis for studying their structure and function, this work aimed to establish an efficient and rapid method for constructing multi-site mutants. When four or more adjacent amino acid residues need to be mutated, firstly, two long and two short primers (long primersⅠ/Ⅲ, short primersⅡ/Ⅳ) were designed: the long primers contain mutated sites, and the number of mutant bases is ≤20 bp, the short primers do not contain mutated sites; GC contents of the long and short primers are ≤80%, and the difference of annealing temperature is ≤40 °C. Then two sets of reverse PCR amplifications were performed using primer pairs (Ⅰ/Ⅱand Ⅲ/Ⅳ) and templates, respectively. After amplification, each system can obtain non-methylated linear plasmids which contain mutated sites, and the breakpoints of the two sets of linear plasmids amplified by primers Ⅰ/Ⅱ and Ⅲ/Ⅳ were distributed on both sides of the mutated sites. Followed by digested byⅠ to remove the methylated templates, the recovered PCR products, which were mixed in an equimolar ratio, were performed another round of denaturation and annealing: the two sets of linear plasmids were denatured at 95 °C and then annealed with each other’s single-stranded DNA as templates to form open-loop plasmids, and then the transformants containing the mutations will be obtained after transformed the open-loop plasmids intocompetent cells. Results showed that, this method can mutate 4 to 11 consecutive amino acid residues (8–20 bp) simultaneously, which will greatly simplify the construction of multi-site mutants, Thereby improve the efficiency of protein structure and function research further.

primer, reverse PCR, site-directed mutagenesis, multilocus mutant

July 13, 2019;

September 16, 2019

Supported by:The Doctoral Foundation of Huanggang Normal University (No. 201802103), the High-level Scientific Research Project Cultivation Fund of Huanggang Normal University (No.201816503).

Yongliang Zheng. Tel: +86-713-8833727; E-mail: 11169214@qq.com

黃岡師范學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金(No. 201802103)，黃岡師范學(xué)院高級(jí)別科研項(xiàng)目培育基金(No. 201816503) 資助。

2019-10-10

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20191010.0945.004.html

10.13345/j.cjb.190311

徐碧林, 朱慶, 陳巖巖, 等. 利用優(yōu)化的反向PCR策略高效構(gòu)建多位點(diǎn)突變體. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(4): 801–809.

Xu BL, Zhu Q, Chen YY, et al. Optimized inverse PCR strategy for constructing multilocus mutants efficiently. Chin J Biotech, 2020, 36(4): 801–809.

(本文責(zé)編 陳宏宇)