崔文文，遲婧，馮艷芳，耿麗麗，劉榮梅

·合成生物技術(shù)·

人工合成根特異啟動(dòng)子SRSP的功能分析

崔文文1,2，遲婧2，馮艷芳1，耿麗麗2，劉榮梅1

1東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000 2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

根負(fù)責(zé)吸收水分和養(yǎng)分，是重要的植物組織，但易受生物及非生物脅迫，影響作物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量。設(shè)計(jì)合成根特異啟動(dòng)子，可為與脅迫相關(guān)的抗性基因在作物根部的功能研究及高效表達(dá)提供候選啟動(dòng)子。文中將4拷貝的根特異性順式作用元件(OSE1ROOTNODULE、OSE2ROOTNODULE、SP8BFIBSP8AIB和ROOTMOTIFAPOX1) 以串聯(lián)排列方式設(shè)計(jì)合成了一個(gè)根特異性模塊(-)，并與來(lái)自CaMV 35S啟動(dòng)子的最小啟動(dòng)子融合，合成一個(gè)人工合成啟動(dòng)子SRSP。通過(guò)替換CaMV 35S啟動(dòng)子將SRSP啟動(dòng)子克隆到pCAMBIA2300.1中以驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)。將攜帶啟動(dòng)子的構(gòu)建體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化到煙草中。GUS組織化學(xué)染色分析和實(shí)時(shí)PCR (RT-PCR) 分析顯示啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因煙草中賦予根特異性表達(dá)。說(shuō)明順式作用元件重復(fù)排列可實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子預(yù)期功能，本研究為理性設(shè)計(jì)植物組織特異啟動(dòng)子奠定了理論基礎(chǔ)。

順式作用元件，根特異啟動(dòng)子，合成啟動(dòng)子，基因

隨著植物啟動(dòng)子中順式作用元件功能研究的逐漸深入，研究者可以根據(jù)生產(chǎn)需要，設(shè)計(jì)合成人工啟動(dòng)子，以便控制目的基因在特定時(shí)間和特定組織的精準(zhǔn)表達(dá)，且可避免由于克隆自植物的啟動(dòng)子可能引起的基因沉默，這對(duì)于植物基因工程育種具有重要的意義[1]。

合成啟動(dòng)子主要通過(guò)核心啟動(dòng)子和上游順式作用元件的組合設(shè)計(jì)而成[2]；核心啟動(dòng)子可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始，并維持最基本的轉(zhuǎn)錄水平，合成啟動(dòng)子中最常用的核心啟動(dòng)子是mini CaMV 35S啟動(dòng)子[3-5]。上游順式元件的多種組合可以設(shè)計(jì)合成具有不同表達(dá)特性的啟動(dòng)子，Dey等[6]總結(jié)了188種合成的啟動(dòng)子，詳細(xì)描述了各啟動(dòng)子中各種順式作用元件的選擇和組合及它們的表達(dá)特性。順式作用元件的排列方式影響啟動(dòng)子的表達(dá)特性，并不是所有的人工合成啟動(dòng)子都能達(dá)到預(yù)期的設(shè)計(jì)效果。王睿等[7]將4種順式作用元件(促進(jìn)基因在葉片表達(dá)的EGATFLK、LPSE1和LSE1元件與抑制基因在種子和莖稈中表達(dá)的LPRSE1元件) 以單拷貝、雙拷貝和3個(gè)拷貝的形式進(jìn)行不同組合排布，以構(gòu)建葉片特異表達(dá)的啟動(dòng)子，其中，Syn3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因在種子、葉片和莖中都有表達(dá)。因此，對(duì)順式作用元件的選擇、組合及其排列方式，是人工合成啟動(dòng)子設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。

植物的地下根系部分對(duì)植物的代謝及吸收起著不可或缺的作用，可對(duì)來(lái)自土壤中水分、無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行吸收利用，為植物的生長(zhǎng)發(fā)育和結(jié)實(shí)提供支持。但來(lái)自土壤的一些生物和非生物脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生了較大的威脅，如土傳病害和地下害蟲(chóng)，嚴(yán)重影響了一些重要糧食和經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量。為了增加植物抗逆性，提高作物產(chǎn)量，尋找并研究根部特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，保證脅迫相關(guān)抗性基因在作物根部特異高效的表達(dá)具有重要意義。

本研究利用4種根特異性順式作用元件OSE1ROOTNODULE、OSE2ROOTNODU-LE、SP8BFIBSP8AIB、ROOTMOTIFTAPOX1，以4個(gè)重復(fù)組合順式排列的方式，與CaMV 35S啟動(dòng)子核心區(qū)及Omega序列連接構(gòu)建了一個(gè)合成啟動(dòng)子，對(duì)其表達(dá)特性進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α細(xì)胞，載體pMD19T，根癌農(nóng)桿菌LBA4404，煙草，植物表達(dá)載體pCAMBIA2300.1，以上材料均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 啟動(dòng)子上游pro-SRS模塊合成

人工合成根特異啟動(dòng)子SRSP上游的根特異性元件由3個(gè)模塊構(gòu)成，分別為、CaMV 35S啟動(dòng)子核心區(qū)、Omega序列；模塊pro-SRS長(zhǎng)度299 bp，具有4種根特異的順式作用元件，每種元件均為4拷貝數(shù)(表1)，該序列由金維智生物科技有限公司合成。對(duì)其上游模塊進(jìn)行擴(kuò)增，引物對(duì)為proSRSFH和proSRSRcd (見(jiàn)表2)；PCR擴(kuò)增條件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

轉(zhuǎn)錄核心區(qū)克?。篜CR法克隆CaMV 35S最小活性區(qū)與Omega序列，模板分別為載體pCMBIA2300.1和Ω序列，PCR引物對(duì)則分別為35SminiFcd/ 35SminiRcd和OmegaFcd/OmegaRB (表2)；PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。重疊PCR方法合成人工啟動(dòng)子SRSP：以proSRSPFH/OmegaRB為引物(表2)，3個(gè)序列產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。

表1 在pro-SRS模塊中的四種根特異的順式作用元件

表2 設(shè)計(jì)啟動(dòng)子所需的引物

Lower case bases indicate added restriction enzyme sites.

1.3 重組植物表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

將啟動(dòng)子及植物表達(dá)載體pCAMBIA2300.1用d Ⅲ和HⅠ雙酶切后連接，重組載體通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌LBA4404中；農(nóng)桿菌介導(dǎo)的對(duì)煙草遺傳轉(zhuǎn)化采用葉盤(pán)法[8]。

1.4 抗性苗的PCR鑒定及T1代植株的RT-PCR分析

SDS法提取煙草基因組，利用基因引物gusJDF/gusJDR (表2) 進(jìn)行PCR鑒定。收獲PCR陽(yáng)性植株種子進(jìn)行RT-PCR分析，Trizol法分別提取轉(zhuǎn)基因煙草根、莖與葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證；煙草內(nèi)參基因引物EF1a/EF1b，基因引物GF/GR序列詳見(jiàn)表2。

1.5 煙草GUS組織化學(xué)染色

對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草T0和T1代植株GUS染液染色，37 ℃避光溫育12 h，F(xiàn)AA固定液固定2 h，無(wú)水乙醇進(jìn)行脫色24 h，超純水清洗后用vhx-2000型超景深三維顯微鏡下觀察GUS染色情況及拍照，并將染色的根進(jìn)行橫切與縱切，顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 根特異啟動(dòng)子SRSP設(shè)計(jì)與合成

為了分析順式作用元件以多個(gè)重復(fù)緊密排列的方式，是否能夠發(fā)揮預(yù)期的功能，設(shè)計(jì)合成的啟動(dòng)子含有OSE1ROOTNODULE、OSE2ROOTNODULE、SP8BFIBSP8AIB、ROOTMOTIFTAPOX1四個(gè)根特異元件，并以4個(gè)重復(fù)組合的方式順序排列(圖2)。SRSP啟動(dòng)子除了含有上游的pro-SRS片段，還含有35S核心區(qū)和Ω序列(圖2)。對(duì)3個(gè)啟動(dòng)子模塊進(jìn)行克隆，模板分別為合成pro-SRS片段、植物表達(dá)載體pCAMBIA2300.1和Ω序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后分別得到pro-SRS片段為313 bp、35S核心啟動(dòng)子片段62 bp和Ω序列片段66 bp (圖1，泳道1條帶、泳道2條帶、泳道3條帶)，重疊PCR擴(kuò)增得到434 bp的人工啟動(dòng)子SRSP片段(圖1，泳道4條帶)。為了與后續(xù)的載體連接，在合成啟動(dòng)子兩端引入了d Ⅲ和HⅠ的雙酶切位點(diǎn)，如圖2所示。

2.2 含有SRSP啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建

將與pMD-19T載體連接得到的重組質(zhì)粒pMD-SRSP與基礎(chǔ)載體pCAMBIA.2300.1進(jìn)行雙酶切(H Ⅰ和d Ⅲ) 并回收，將得到啟動(dòng)子片段與載體pCAMBIA.2300.1連接，獲得表達(dá)載體p2300.1-SRSP (圖3A)。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌LBA4404，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增條帶與預(yù)計(jì)啟動(dòng)子大小片段一致(圖3B)。

圖1 pro-SRS、35S-mini promoter、Ω模塊及啟動(dòng)子SRSP序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 人工合成根特異性啟動(dòng)子SRSP結(jié)構(gòu)示意圖

圖3 重組載體p2300.1-SRSP的構(gòu)建和T1轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR分析

2.3 RT-PCR分析轉(zhuǎn)基因T1代煙草GUS表達(dá)特性

對(duì)獲得的PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行移栽，并收獲種子。種植轉(zhuǎn)p2300.1-SRSP煙草的T1代植株，提取基因組并進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果7株抗性苗均能擴(kuò)增出250 bp左右的基因(圖3C)。分別提取T1代轉(zhuǎn)基因煙草根、莖與葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄，RT-PCR結(jié)果表明，只有根部可以擴(kuò)增出基因(圖3D)，說(shuō)明SRSP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因只在根部進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色

對(duì)其T0代和T1代煙草植株進(jìn)行GUS化學(xué)組織分析，超景深顯微鏡下觀察(圖4)，染色結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草根部全部染成藍(lán)色，葉片未染成藍(lán)色，說(shuō)明SRSP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因在煙草根部的特異表達(dá)。根部切片結(jié)果表明，韌皮部染色較深，維管柱的其余結(jié)構(gòu)如木質(zhì)部也被染成藍(lán)色(圖5)，基因在韌皮部表達(dá)量高，髓部無(wú)表達(dá)；根部表皮幾乎未被染成藍(lán)色，基因在表皮中表達(dá)量很少，形成層也有基因的表達(dá)，縱切中根的皮層呈現(xiàn)彌散分布。

圖4 轉(zhuǎn)SRSP的煙草的GUS組織染色

圖5 轉(zhuǎn)SRSP煙草GUS染色后的根部的橫切圖與縱切圖

3 討論

植物基因工程中，啟動(dòng)子的選取和使用對(duì)基因的表達(dá)起著至關(guān)重要的作用，啟動(dòng)子作為調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的重要序列，其應(yīng)用非常廣泛[13-14]。組織特異性啟動(dòng)子可以調(diào)控外源基因在特定的組織或器官中表達(dá)，因而避免了因外源蛋白的組成型表達(dá)對(duì)植物造成的毒害及營(yíng)養(yǎng)的浪費(fèi)[15-16]。但天然的組織特異啟動(dòng)子數(shù)量有限，且具有一定局限性，隨著轉(zhuǎn)基因作物疊加基因策略的應(yīng)用，可能會(huì)產(chǎn)生同源依賴性的基因沉默現(xiàn)象(Homology- dependent gene silencing，HDGS) 和不良重組的產(chǎn)生[17]。因此，設(shè)計(jì)人工合成啟動(dòng)子，其可在特定時(shí)間和空間精準(zhǔn)表達(dá)的特點(diǎn)，更易于滿足研究者的需求。

啟動(dòng)子通過(guò)不同的順式作用元件對(duì)下游基因起到調(diào)控作用，這些順式作用元件的種類、數(shù)量及排列方式都可能影響下游基因的轉(zhuǎn)錄水平[18]。Liu等[19]的研究表明4個(gè)重復(fù)的誘導(dǎo)調(diào)控元件可在人工啟動(dòng)子中發(fā)揮功能，構(gòu)建的啟動(dòng)子均可受相應(yīng)的激素(乙烯、水楊酸、茉莉酸甲酯) 誘導(dǎo)表達(dá)。順式作用元件之間需要一定的間隔從而提高轉(zhuǎn)錄因子的附著率，有研究表明5 bp的間隔可使元件與轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行正常的結(jié)合而調(diào)控基因表達(dá)，而4個(gè)拷貝數(shù)的順式作用元件就可提高原基因表達(dá)水平的30倍[20]。Mohan等[21]構(gòu)建了1個(gè)根特異性合成啟動(dòng)子模塊SynR，此模塊含7個(gè)順式作用元件(1×MYB core、2×ROOT MOTIF、1×ELRECOREPC、1×MAR框、1×ARFAT元件、1×LEAFYATAG)；每個(gè)元件間隔10 bp，間隔序列為T(mén)CATAACGCT。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)拷貝數(shù)的根特異性元件OSE1ROOTNODULE、OSE2ROOTNODULE、SP8BFIBSP8AIB、ROOTMOTIFTAPOX1進(jìn)行組合，順式作用元件的間隔序列在2–22 bp之間，能保證其發(fā)揮功能，構(gòu)建的合成啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在煙草根部的特異表達(dá)，為組織特異性啟動(dòng)子設(shè)計(jì)中順式作用元件的選擇和排列組合方式提供理論指導(dǎo)。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了一個(gè)由4種根特異表達(dá)順式作用元件重復(fù)排列構(gòu)成的人工啟動(dòng)子SRSP，RT-PCR及GUS染色的結(jié)果表明，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在T0和T1代煙草根部的特異表達(dá)。為利用組織特異表達(dá)順式作用元件構(gòu)建高效、穩(wěn)定和可控的組織特異性啟動(dòng)子奠定了基礎(chǔ)。

[1] Mehrotra R, Gupta G, Sethi R, et al. Designer promoter: an artwork ofengineering. Plant Mol Biol, 2011, 75(6): 527–536.

[2] Bi?asR, Szafran K, Hnatuszko-Konka K, et al.regulatory elements used to control gene expression in plants. Plant Cell, Tissue Organ Cult, 2016, 127(2): 269–287.

[3] Bhullar S, Chakravarthy S, Advani S, et al. Strategies for development of functionally equivalent promoters with minimum sequence homology for transgene expression in plants:elements in a novel DNA context versus domain swapping. Plant Physiol, 2003, 132(2): 988–998.

[4] Bhullar S, Datta S, Advani S, et al. Functional analysis of cauliflower mosaic virus 35S promoter: re-evaluation of the role of subdomains B5, B4 and B2 in promoter activity. Plant Biotechnol J, 2007, 5(6): 696–708.

[5] Bhullar S, Datta S, Burma PK. Delayed-inactivation of synthetic domain a 35S promoters by “tobacco 271 locus” due to reduced sequence homology. Plant Mol Biol Rep, 2011, 29(1): 1–11.

[6] Dey N, Sarkar S, Acharya S, et al. Synthetic promoters in planta. Planta, 2015, 242(5): 1077–1094.

[7] Wang R, Zhu ML, Gao FY, et al. Designing, construction and functional characterization of tissue-specific synthetic promoter in rice. Acta Agronom Sin, 2017, 43(6): 789–794 (in Chinese). 王睿, 朱夢(mèng)琳, 高方遠(yuǎn), 等. 水稻組織特異型人工合成啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)、構(gòu)建及功能鑒定. 作物學(xué)報(bào), 2017, 43(6): 789–794.

[8] Feng YF. Cloning and fanction of peanut root-specific promoters[D]. Linfen: the Normal University of Shanxi, 2016 (in Chinese). 馮艷芳. 花生根特異啟動(dòng)子的克隆及功能分析[D].臨汾: 山西師范大學(xué), 2016.

[9] Ishiguro S, Nakamura K. The nuclear factor SP8BF binds to the 5′-upstream regions of three different genes coding for major proteins of sweet potato tuberous roots. Plant Mol Biol, 1992, 18(1): 97–108, doi: 10.1007/BF00018460

[10] Elmayan T, Tepfer M. Evaluation in tobacco of the organ specificity and strength of thepromoter, domain A of the 35S promoter and the 35S2promoter. Transgenic Res, 1995, 4(6): 388–396.

[11] Vieweg MF, Frühling M, Quandt HJ, et al. The promoter of theL. Leghemoglobin geneis specifically activated in the infected cells of root nodules and in the arbuscule-containing cells of mycorrhizal roots from different legume and nonlegume plants. Mol Plant-Microbe Interact, 2004, 17(1): 62–69.

[12] Zhang C, Pan SF, Chen H, et al. Characterization of, a novel root-specific gene from tobacco, and upstream promoter activity analysis in homologous and heterologous hosts. Plant Cell Rep, 2016, 35(4): 757–769.

[13] Bisht NC, Jagannath A, Gupta V, et al. A two gene—two promoter system for enhanced expression of a restorer gene () and development of improved fertility restorer lines for hybrid seed production in crop plants. Molecular Breeding 2004, 14(2): 129–144.

[14] Gurr SJ, Rushton PJ. Engineering plants with increased disease resistance: how are we going to express? Trends Biotechnol, 2005, 23(6): 283–290, doi: 10.1016/j.tibtech.2005.04.009.

[15] Porto MS, Pinheiro MPN, Batista VG, et al. Plant promoters: an approach of structure and function. Mol Biotechnol, 2014, 56(1): 38–49.

[16] Stoger E, Williams S, Keen D, et al. Constitutive versus seed specific expression in transgenic wheat: temporal and spatial control. Transgenic Research, 1999, 8(2): 73–82.

[17] Moshelion M, Altman A. Current challenges and future perspectives of plant and agricultural biotechnology. Trends Biotechnol, 2015, 33(6): 337–342.

[18] Szabados L, Charrier B, Kondorosi A, et al. New plant promoter and enhancer testing vectors. Mol Breed, 1995, 1(4): 419–423.

[19] Liu WS, Mazarei M, Rudis MR, et al. Rapidanalysis of synthetic promoters for plant pathogen phytosensing. BMC Biotechnol, 2011, 11: 108.

[20] Rushton PJ, Reinst?dler A, Lipka V, et al. Synthetic plant promoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogen- and wound- induced signaling. Plant Cell, 2002, 14(4): 749–762.

[21] Mohan C, Jayanarayanan AN, Narayanan S. Construction of a novel synthetic root-specific promoter and its characterization in transgenic tobacco plants. 3 Biotech, 2017, 7: 234.

Construction and function of a root-specific promoter SRSP

Wenwen Cui1,2, Jing Chi2, Yanfang Feng1, Lili Geng2, and Rongmei Liu1

1,,150000,,2,,,100193,

The responsibility of root is absorbing water and nutrients, it is an important plant tissue, but easily to be affected by biotic and abiotic stresses, affecting crop growth and yield. The design of a synthetic root-specific promoter provides candidate promoters for the functional analysis and efficient expression of stress-related genes in crop roots. In this study, a synthetic root-specific module (pro-SRS) was designed using tandem four-copies of root specific cis-acting elements (OSE1ROOTNODULE, OSE2ROOTNODULE, SP8BFIBSP8AIB, and ROOTMOTIFAPOX1), and fused with minimal promoter from the CaMV 35S promoter to synthesize an artificially synthetic SRSP promoter. The SRSP promoter was cloned in pCAMBIA2300.1 by replacing CaMV 35S promoter so as to drive GUS expression. The constructs with SRSP promoter were transformed in tobacco by-mediated method. SRSP promoter conferred root-specific expression in transgenic tobacco plants through Real-time PCR (RT-PCR) analysis and GUS histochemical staining analysis. It is indicated that the repeated arrangement of-acting elements can realize the expected function of the promoter. This study laid a theoretical foundation for the rational design of tissue-specific promoters.

-acting elements, root-specific promoter, synthetic promoter,

June 17, 2019;

September 23, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31501711).

Rongmei Liu. Tel: +86-451-55190948; E-mail: 234388435@qq.com

Lili Geng. Tel: +86-10-62812642; E-mail: llgeng@ippcaas.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31501711) 資助。

10.13345/j.cjb.190259

2019-11-07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20191107.1546.001.html

崔文文, 遲婧, 馮艷芳, 等. 人工合成根特異啟動(dòng)子SRSP的功能分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(4): 700–706.

Cui WW, Chi J, Feng YF, et al. Construction and function of a root-specific promoter SRSP. Chin J Biotech, 2020, 36(4): 700–706.

(本文責(zé)編 陳宏宇)