李德龍，譚理娟，谷九龍，王思媛，劉婷，陳思懷，高繼業(yè)，唐發(fā)書，李繼祥

·動物及獸醫(yī)生物技術(shù)·

鴨的克隆、表達及其與鴨疫里默氏菌的互作

李德龍，譚理娟，谷九龍，王思媛，劉婷，陳思懷，高繼業(yè)，唐發(fā)書，李繼祥

西南大學 動物科學學院，重慶 402460

為研究鴨C4結(jié)合蛋白 (C4b-binding protein，C4BP) 與鴨疫里默氏菌 (，RA) 的相互作用，對鴨進行克隆、原核表達，免疫小鼠制備多克隆抗體，并利用間接免疫熒光試驗及斑點雜交試驗驗證C4BP與RA的相互作用。結(jié)果顯示，鴨核苷酸序列全長為1 230 bp，與雞的相似性最高 (82.1%)；系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，鴨與雞處于同一系統(tǒng)進化樹分支上，兩者遺傳進化關(guān)系最近；C4BPα在大腸桿菌BL21 (DE3) 中能高效表達，重組蛋白以胞內(nèi)可溶性形式存在；多克隆抗體效價超過1∶10 000，并且可以與重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)；間接免疫熒光試驗和斑點雜交試驗結(jié)果顯示RA與鴨C4BP可以發(fā)生相互作用。研究結(jié)果為進一步揭示RA的致病機制奠定了基礎(chǔ)。

鴨C4結(jié)合蛋白α，克隆，原核表達，鴨疫里默氏菌

鴨疫里默氏菌 (，RA)是一種不運動、無芽胞的革蘭氏陰性小桿菌[1]，主要感染1–8周齡鴨，但以2–3周齡鴨最易感，發(fā)病率和死亡率均很高，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了較大經(jīng)濟損失[2-3]。一旦RA感染了鴨群，就會逐漸發(fā)展為地方流行性疾病[2]，而且細菌的反復感染及耐藥性也給該病的防治帶來了很大困難[4-6]。只有揭示了RA的致病機制，才能更好地防控該病。

病原性細菌感染宿主，必須采取有效措施逃避、抵抗和戰(zhàn)勝宿主的先天免疫應(yīng)答。補體系統(tǒng)是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，由30多種蛋白組成，具有識別與消除外來病原體、激活免疫細胞和調(diào)控獲得性免疫等功能[7-8]。補體系統(tǒng)主要通過經(jīng)典途徑、凝集素途徑和旁路途徑激活，形成攻膜復合物 (Membrane attack complex，MAC)，可以直接裂解革蘭氏陰性菌[9-10]，但有的細菌可通過不同方式逃避補體系統(tǒng)的清除[11]。據(jù)報道，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌及大腸桿菌等革蘭氏陰性菌可以通過表面蛋白捕獲宿主血清中C4結(jié)合蛋白 (C4b-binding protein，C4BP)以達到逃避補體攻擊的目的[11-12]。C4BP由7個α鏈和1個β鏈組成的糖蛋白，分子量約為570 kDa，其中每條α鏈含有8個短同源重復序列 (Short consensus repeats，SCRs)，β鏈含有3個SCRs[13-15]。C4BP主要通過α鏈SCRs 1-3與C4b結(jié)合以干擾C3轉(zhuǎn)化酶 (C4bC2a) 的組裝與衰變，并作為I因子的輔助因子抑制補體系統(tǒng)經(jīng)典途徑激活[15-17]。目前研究多集中于人和鼠C4BP，而未見鴨C4BP相關(guān)研究報道，也缺乏相關(guān)抗體等試劑。RA是危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要病原性細菌，其在致病過程中能否通過與鴨C4BP發(fā)生相互作用從而逃避補體系統(tǒng)的攻擊目前尚不清楚。

本研究在克隆、原核表達鴨C4BPα及制備多克隆抗體基礎(chǔ)上，利用間接免疫熒光試驗 (Immunofluorescence assay，IFA) 和斑點雜交試驗研究鴨C4BPα與RA相互作用，為揭示RA逃避補體系統(tǒng)清除的機制奠定基礎(chǔ)，同時為進一步研發(fā)RA疫苗提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

10日齡健康雛鴨 (櫻桃谷鴨) 購自重慶永健生物技術(shù)有限公司。6–8周齡SPF級雌性昆明小鼠購自西南醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2 菌株和載體

大腸桿菌DH5α和BL21 (DE3)，原核表達載體pCold-TF均由西南大學動物科學學院動物疫病防控與獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究室保存。

1.1.3 主要試劑

PrimeScriptTMRT Master Mix、? DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶HⅠ和d Ⅲ及DNA Ligation Kit等購自寶日醫(yī)生物技術(shù) (北京) 有限公司；EZ-10柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒等購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；HRP標記山羊抗鼠IgG、FITC標記山羊抗鼠IgG和TRIzol等購自Sigma公司；健康鴨血清采集自10日齡健康鴨；TF標簽蛋白及鼠抗TF標簽蛋白血清由本研究課題組制備并保存。

1.2 方法

1.2.1 鴨基因克隆與分析

據(jù)文獻查閱，未見有鴨序列的報道，本試驗參考NCBI雞mRNA序列 (GenBank登錄號NM_204664.2) 設(shè)計引物(上游引物：5′-ATGCAGAGCTTTCCCGTTGGAA-3′；下游引物5′-TCATTTACAGCTCGTATATTTGGC-3′) 用于核苷酸序列擴增，引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。

健康雛鴨靜脈放血處死，無菌采集肝臟組織100 mg，放入液氮預冷的研缽中研磨，利用TRIzol抽提法提取總RNA，并據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠并用DNA凝膠回收試劑盒回收目的DNA。

將回收的DNA與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，PCR鑒定，武漢金開瑞生物工程有限公司測序 (命名為pMD-C4BPα)。利用NCBI BLAST和DNAStar MegAlign (Cluster W方法) 軟件進行序列分析。利用clustal X 1.83和MEGA X (Neighbor-Joining method，bootstrap值為1 000) 進行遺傳進化樹分析。

1.2.2 重組蛋白的誘導表達

根據(jù)密碼子優(yōu)化軟件OptimumGeneTM對目的DNA核苷酸序列進行分析，序列中存在稀有密碼子，按照大腸桿菌最適密碼子人工合成，命名為()。以pCold-TF構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pCold-TF-C4BPα(m)，轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)，并用抗生素平板篩選單菌落，擴大培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至新鮮含Amp的液體LB，37 ℃、 180 r/min培養(yǎng)2.5 h (值約為0.6–0.8)。15 ℃靜置30 min，加入終濃度為1.0 mmol/L IPTG，15 ℃、180 r/min誘導表達24 h。收集菌液，離心后用PBS重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎菌體至懸液澄清，8 500×、4 ℃離心15 min，分別收集上清和沉淀，用于12% SDS-PAGE檢測。

1.2.3 多克隆抗體的制備及鑒定

TF-C4BPα(m) 表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分離，切取重組蛋白TF-C4BPα(m) 凝膠條帶，烘干、研磨，加適量生理鹽水后充分勻漿制備成免疫抗原。將 16只6–8周齡SPF級雌性昆明小鼠隨機分為2組，8只/組，隔離飼養(yǎng)，一組皮下注射TF-C4BPα (m) 蛋白免疫抗原，另一組皮下注射0.1 mL PBS作為健康對照。以相同劑量加強免疫2次，間隔時間為2周。第2次加強免疫后2周摘眼球采血并分離血清，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

ELISA鑒定：將TF-C4BPα(m) 蛋白用50 mmol/L碳酸鹽緩沖液 (pH 9.6) 稀釋為5 μg/mL，每孔 100 μL，4 ℃包被過夜；每孔200 μL 5%脫脂奶粉封閉，37 ℃封閉2 h；稀釋的鼠抗鴨C4BPα(m)血清，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h。二抗為HRP標記的山羊抗鼠IgG (1∶5 000)。TMB避光顯色 15 min，2 mol/L H2SO450 μL/孔，酶標儀測定450。試驗中，用健康鼠血清作為陰性對照。判定標準：S/N=(樣品450)/(陰性對照450)，S/N>2.1為陽性。

Western blotting鑒定：將TF-C4BPα(m) 蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯 (Polyvinylidene difluoride，PVDF) 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉l h，再與鼠抗鴨C4BPα(m) 血清4 ℃過夜孵育，加入HRP標記山羊抗鼠IgG二抗，室溫孵育1 h，DAB避光顯色。

1.2.4 間接免疫熒光試驗

利用IFA鑒定RA能否與鴨血清中C4BP發(fā)生相互作用，步驟參照文獻[18]并進行適當改進。在巧克力培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)RA-AF株，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取平板上的單菌落于LB中培養(yǎng)，PBS洗3次后懸浮至均勻濃度，制備涂片；多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次；10%健康鴨血清與涂片在37 ℃濕盒中孵育1 h，PBS洗3次；鼠抗鴨C4BPα(m) 血清為一抗，4 ℃過夜作用，PBS洗 3次；FITC標記山羊抗鼠IgG為二抗，37 ℃孵育 1 h (避光)，PBS洗3次，熒光顯微鏡觀察。試驗中，鼠抗TF標簽蛋白血清代替鼠抗鴨C4BPα(m)血清為陰性對照組，健康鼠血清代替鼠抗鴨C4BPα(m) 血清為空白對照組。

1.2.5 斑點雜交試驗

利用斑點雜交試驗鑒定RA能否與C4BPα發(fā)生相互作用，步驟參照文獻[19]并進行適當改進。

樣品制備：RA純培養(yǎng)物經(jīng)PBS洗3次后用明膠維羅納緩沖鹽水 (Gelatin veronal buffered saline，GVBS++) 將菌液濃度調(diào)至1.9×109CFU/mL；TF-C4BPα(m) 重組蛋白、10%健康鴨血清和20%健康鴨血清分別與菌液在37 ℃孵育1 h，GVBS洗3次；離心后重懸于0.06 mol/L Tris buffer (2% SDS)，煮沸5 min；12 000×離心5 min，上清即為待測樣品。TF標簽蛋白代替TF-C4BPα(m) 重組蛋白為陰性對照組。

試驗步驟：將3 μL待測樣品滴加于PVDF膜中央，室溫靜置10 min；5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，TBST洗3次；鼠抗鴨C4BPα(m) 血清為一抗，4 ℃過夜作用，TBST洗3次；HRP標記山羊抗鼠IgG為二抗，37 ℃作用孵育1 h，TBST洗 3次；DAB避光顯色10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆與序列分析

以鴨肝組織總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，得到一個大小為1 230 bp的特異性片段(圖1)。經(jīng)NCBI BLAST比對，與雞(GenBank登錄號NM_204664.2) 的相似性為82.1%。通過對系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，與雞在核苷酸和氨基酸水平上均處于同一分支，遺傳進化關(guān)系最近 (圖2)。本研究獲得的鴨基因序列已上傳至GenBank，登錄號為MH282865.1。

2.2 重組蛋白的檢測和存在形式鑒定

pCold-TF-C4BPα(m)/.BL21用終濃度為1.0 mmol/L IPTG進行誘導表達，SDS-PAGE可檢測到菌體中存在多量表達且分子量約為93 kDa的重組蛋白，與預期重組蛋白TF-C4BPα(m) 大小一致。檢測超聲破碎菌體上清和沉淀，表達蛋白在上清中，表明重組蛋白為胞內(nèi)可溶性表達 (圖3)。

圖1 C4BPα基因的PCR產(chǎn)物

圖2 C4BPα基因系統(tǒng)進化樹分析

圖3 pCold-TF-C4BPα(m)/E. coli BL21重組表達的SDS-PAGE分析

2.3 ELISA檢測多克隆抗體效價

經(jīng)ELISA檢測，鼠抗鴨C4BPα(m)血清在稀釋度1∶10 000所測得的平均450為0.605，S/N均大于2.1，因此制備的多克隆抗體鑒定為陽性，同時可以判斷所獲抗體效價較高，超過1∶10 000，但是低于1∶100 000 (表1)。

2.4 多克隆抗體與TF-C4BPα(m) 特異性結(jié)合

Western blotting檢測多克隆抗體的特異性。經(jīng)檢測，PVDF膜上出現(xiàn)一條清晰的約為93 kDa條帶。由此可見，鼠抗鴨C4BPα(m) 血清可以與重組蛋白TF-C4BPα(m) 特異性結(jié)合 (圖4)。

2.5 間接免疫熒光鑒定C4BPα與RA相互作用

IFA鑒定鴨C4BP與RA相互作用。試驗組為鼠抗鴨C4BPα(m)血清為一抗，可見許多散在綠色熒光點 (圖5A)；陰性對照組 (鼠抗TF標簽蛋白血清為一抗)和空白對照組 (健康鼠血清代替一抗鼠血清)幾乎未見綠色熒光點 (圖5B–C)。

2.6 斑點雜交試驗鑒定C4BPα與RA相互作用

用斑點雜交試驗鑒定鴨C4BPα與RA相互作用。RA與TF-C4BPα(m)重組蛋白作用雜交斑點較清晰，RA與10%和20%健康鴨血清作用呈現(xiàn)雜交斑點，但與20%血清作用的斑點顏色較淺，而以TF標簽蛋白代替TF-C4BPα(m)重組蛋白的陰性對照組未出現(xiàn)明顯的雜交斑點 (圖6)。

表1 鼠抗鴨C4BPα(m)多克隆抗體ELISA結(jié)果

圖4 鼠抗鴨C4BPα(m) 多克隆抗體Western blotting結(jié)果

圖5 IFA檢測鴨C4BPα與RA相互作用 (800×)

圖6 斑點雜交試驗檢測鴨C4BPα與RA相互作用

3 討論

補體系統(tǒng)是抵抗病原微生物入侵宿主的主要非特異性免疫系統(tǒng)之一，而病原微生物也進化出招募并利用宿主液相補體調(diào)節(jié)蛋白來保護自己免受補體系統(tǒng)攻擊的本領(lǐng)，C4BP就是最常見的補體負調(diào)節(jié)蛋白之一[20]。C4BP通過干擾C3轉(zhuǎn)化酶C4bC2a的組裝與衰變，以及作為I因子的輔助因子抑制經(jīng)典途徑的活化而發(fā)揮補體系統(tǒng)負調(diào)節(jié)作用[15-16]。RA可以分泌胞外蛋白酶抑制補體系統(tǒng)經(jīng)典途徑和凝集素途徑激活[21]，但是RA能否通過與鴨C4BP發(fā)生相互作用從而逃避補體系統(tǒng)的攻擊目前尚不清楚。

由于C4BP分子量大且可與血清其他成分形成復合物，因此從血清中直接提純C4BP難度較大[22]。研究發(fā)現(xiàn)，α鏈是C4BP與C4b結(jié)合的主要功能區(qū)域，C4BPα的SCRs 1-3與C4b結(jié)合后，能夠干擾經(jīng)典途徑和凝集素途徑C3及C5轉(zhuǎn)化酶的組裝，并通過I因子增強C4b的蛋白水解裂解能力[23-25]。因此本研究克隆鴨基因，序列比對分析后發(fā)現(xiàn)鴨與雞遺傳進化關(guān)系最近。隨后將pCold-TF-C4BPα(m)/.BL21進行誘導表達，成功獲得重組蛋白TF-C4BPα(m)，同時檢測超聲破碎菌體上清和沉淀，發(fā)現(xiàn)重組蛋白為胞內(nèi)可溶性表達，這就為后期蛋白的收集及純化提供了便利。在制備免疫抗原時，本研究未采用鎳柱親和層析，考慮到制備多克隆抗體重組蛋白的用量較大，所以采取切膠純化的方式，這種方法具有操作方便、快速、成本低并且無需佐劑的優(yōu)點，同時制備的抗體效價高，特異性好。制備的鼠抗鴨C4BPα(m) 血清經(jīng)ELISA檢測效價超過1∶10 000，另外Western blotting結(jié)果也表明多克隆抗體可以與重組蛋白TF-C4BPα(m) 特異性結(jié)合，說明多克隆抗體制備成功，且特異性較好。

為研究RA與C4BPα相互作用關(guān)系，本研究進行了IFA和斑點雜交試驗。以鼠抗鴨C4BPα(m)血清為一抗進行的IFA，在熒光顯微鏡下可觀察到多量的綠色熒光斑點，而以鼠抗TF標簽蛋白血清及健康鼠血清作對照未能觀察到明顯的綠色熒光斑點。同時，在斑點雜交試驗中，RA與TF-C4BPα(m) 重組蛋白及健康鴨血清作用，均能出現(xiàn)可見的雜交斑點，但與TF標簽蛋白作用不出現(xiàn)雜交斑點。以上結(jié)果顯示，IFA和斑點雜交試驗驗證RA與鴨C4BPα互作具有特異性，RA能招募健康鴨血清中的C4BP。在斑點雜交試驗中，RA與20%血清作用后檢測的斑點比10%血清淺，這一結(jié)果與文獻[19]報道的結(jié)果一致。

綜上所述，本研究成功克隆了鴨基因，序列分析發(fā)現(xiàn)鴨與雞遺傳進化關(guān)系最近，制備的鼠源多克隆抗體效價較高、特異性較好，IFA和斑點雜交試驗成功驗證RA能與鴨血清C4BP發(fā)生相互作用。本研究為揭示RA逃避補體系統(tǒng)清除的機制奠定了基礎(chǔ)，同時為進一步研發(fā)RA疫苗提供了新思路。

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Cloning and expression of duckand verification of its interaction with

Delong Li, Lijuan Tan, Jiulong Gu, Siyuan Wang, Ting Liu, Sihuai Chen, Jiye Gao, Fashu Tang, and Jixiang Li

,,402460,

To study the interaction between C4b-binding protein (C4BP) and(RA), we cloned duck, conducted prokaryotic expression and prepared the polyclonal antibody by immunizing mice. Then indirect immunofluorescence assay and dot blotting hybridization assay were used to verify the interaction between C4BP and RA. The full length of ducknucleotide sequence was 1 230 bp, with the highest similarity to chicken(82.1%). Phylogenetic tree analysis showed that duckand chickenwere on the same phylogenetic tree branch and the genetic evolution relationship between them was the closest. C4BPα was efficiently expressed inBL21(DE3). The recombinant proteins existed in intracellular soluble form. The titer of polyclonal antibody was more than 1:10 000 and polyclonal antibodies could specifically recognize the recombinant proteins. The results of indirect immunofluorescence assay and dot blot hybridization assay showed that RA could interact with duck C4BP. The results provide a basis to further reveal the pathogenesis of RA.

duck C4 binding protein α, cloning, prokaryotic expression,

June 4, 2019;

November 29, 2019

Supported by: The Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. XDJK2018C055), Southwestern University PhD Fund Project (No. 20700506).

Jixiang Li. Tel: +86-23-46751058; E-mail: jixianglucky@126.com

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目 (No. XDJK2018C055)，西南大學博士基金 (含引進人才計劃) 項目 (No. 20700506) 資助。

10.13345/j.cjb.190234

2020-03-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20200305.1023.001.html

李德龍, 譚理娟, 谷九龍, 等. 鴨的克隆、表達及其與鴨疫里默氏菌的互作. 生物工程學報, 2020, 36(4): 693–699.

Li DL, Tan LJ, Gu JL, et al. Cloning and expression of duckand verification of its interaction with. Chin J Biotech, 2020, 36(4): 693–699.

(本文責編 郝麗芳)