高建芳，柯麗萍，孫玉強

·綜 述·

基于花青素代謝培育藍色花卉的研究進展

高建芳，柯麗萍，孫玉強

浙江理工大學 生命科學與醫(yī)藥學院 植物基因組與彩色纖維分子改良實驗室，浙江 杭州 310018

花色是植物吸引昆蟲傳播花粉的主要因素，對于植物在自然界的生存必不可少，也是觀賞植物最重要的性狀之一。在蓬勃發(fā)展的花卉產(chǎn)業(yè)中，色彩各異花卉的培育，可以彌補自然花色的匱乏，但是令人垂涎的藍色花比較難培育。花色的多樣性主要是由花青素及其衍生物的種類和含量等因素決定的，飛燕草色素的合成是形成藍色花的關鍵因素，許多植物體內(nèi)缺少合成飛燕草色素的結(jié)構(gòu)基因。近年來，利用基因工程技術培育藍色花的研究也時有報道。文中以常見的觀賞植物為例，基于花青素代謝調(diào)控，從影響飛燕草色素合成的關鍵因素和不同分子改良途徑培育藍色花等幾個方面對植物花朵呈色的機制進行了綜述，并展示不同分子育種策略可能在其他領域的應用，為其他植物或經(jīng)濟作物的色澤改良如彩色棉藍色纖維的培育等提供參考和技術支持。

基因工程，花色改良，藍色花卉，花青素苷

五彩繽紛的花朵，是大自然進化的杰作，更是人工選擇和培育的結(jié)果。億萬年前，裸子植物主要依靠風力傳粉，后來進化的被子植物有了花被，分化出五顏六色的花萼和花冠，有些還生有蜜腺，分泌汁液或散發(fā)香味，吸引昆蟲或鳥類為其授粉[1-2]。此外，花色的形成能有效防御害蟲和紫外線照射，對植物在自然界的生存和繁衍起重要作用。從觀賞的角度來看，花色是觀賞植物最重要的性狀之一，是花卉育種者關注的焦點和選擇的目標性狀。然而，自然界中藍色系花卉的數(shù)量極少，僅占所有花卉的15%–20%，并且只在極少數(shù)高度進化的被子植物家族中存在[3]，所以在這種情況下，用傳統(tǒng)的育種方法培育藍色花朵非常困難。時至今日，玫瑰、菊花、百合和康乃馨等常見的觀賞性花卉都無法利用傳統(tǒng)的育種方法創(chuàng)造出藍色的花朵，因為它們的基因組中不具有產(chǎn)生藍色花系的基因，利用雜交、回交育種等方法難以實現(xiàn)藍色花卉的培育[4-5]。

飛燕草色素是植物花青素的一種，早在1988年，黃胤怡等對18種藍色花系植物花瓣的色素組成進行分析，發(fā)現(xiàn)飛燕草色素是藍色花卉中最常見、最主要的花色素[6]。植物呈現(xiàn)藍色，在一定程度上還與金屬離子、花青素所在液泡中的pH值、花青素苷修飾和結(jié)構(gòu)的多樣性及環(huán)境因子等因素有關，但最重要的是飛燕草色素在花瓣細胞中的存在。在花青素合成代謝通路中，類黃酮3’,5’羥基化酶 (Flavonoid-3’,5’-hydoxylase，F(xiàn)3’5’H) 是產(chǎn)生藍色花色素的關鍵酶，因此編碼該酶的基因也被稱為藍色基因。另外，花青素的含量對花色的改變也有重要作用，Ohno等對15個不同顏色的大麗花品種進行色彩、黃酮類化合物成分和花青素含量測定分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同顏色的大麗花中含有的黃酮類化合物成分不同。進一步研究發(fā)現(xiàn)深紫色、紫色和粉紅色品種的黃酮組成沒有差異，花青素含量卻依次降低，而在象牙白品種中未檢測到花青素[7]。還有研究報道了在合成飛燕草色素苷的基礎上進行后續(xù)的修飾才能得到藍色色素[8]。

近年來，利用基因工程培育新型花卉的成功報道日益增多，定向改造花卉顏色的技術也發(fā)展迅速，這樣就使得不同藍色花系品種的培育成為可能。利用基因工程，可從以下幾個途徑來改良花卉的藍色性狀。一種是定量定性地控制花卉內(nèi)源類黃酮色素的組成和含量，可通過RNAi、反義RNA技術和基因編輯等技術抑制與內(nèi)源花青素合成相關的關鍵基因，大量積累無色底物，使花色變淺甚至無色，現(xiàn)在的基因編輯技術可以精確編輯相關基因，能更高效徹底降低本底色素關鍵酶基因的表達量。其次是積累花卉非天然色素，通過導入編碼類黃酮3’,5’-羥化酶的基因，使花卉累積飛燕草色素及衍生物，花卉顏色變?yōu)樽仙蛩{色[9]。再者，通過調(diào)控花青素合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子的表達改變花色等性狀[10-11]，這也是改良花色的一條重要途徑。此外，合成生物學可以系統(tǒng)設計分子模塊，對植物體內(nèi)的基礎元件進行人工組裝，構(gòu)建出復雜的類黃酮色素合成、轉(zhuǎn)運和沉積通路，改變花青素類代謝通路或代謝調(diào)控，使花色的改良更加可控。

文中將介紹植物花色素合成的主要途徑，并對藍色花形成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因進行詳細的剖析，闡述花青素苷的結(jié)構(gòu)修飾對藍色花形成的影響，并且根據(jù)基因工程培育藍色花的成功案例，簡要歸納了不同基因工程改良策略，為藍色花卉的培育提供理論參考，并為其他植物的色澤改良或花青素累積提供技術支持，如彩色棉藍色纖維的培育等。棉花是一種不可替代的經(jīng)濟作物，彩色棉纖維具有天然色彩，在紡織過程中無需染色，可減少廢水的排放和加工成本，并且避免化學染料對人體的傷害。但是天然彩色棉顏色類型單一，生產(chǎn)上只有綠色和棕色兩種色系，這嚴重限制了彩棉行業(yè)的發(fā)展，因此，創(chuàng)造不同色澤的彩色棉具有重大意義。

1 植物花青素的結(jié)構(gòu)與合成途徑

花青素是廣泛存在于自然界中的一種植物水溶性色素，是一類重要的黃酮類化合物[12]。花青素是糖基化的多酚類化合物，在植物花朵、種子、果實等組織中，呈現(xiàn)出橙色、紅色、紫色和藍色等不同顏色[13]。自然界中天然存在的花青素有250多種，已經(jīng)確定的有20種，在植物中常見的有6種[14]，分別為天竺葵色素 (Pelargonidin，Pg)、矢車菊色素(Cyanidin，Cy)、飛燕草色素 (Delphindin，Dp)、芍藥色素 (Peonidin，Pn)、錦葵色素 (Malvidin，Mv) 和矮牽牛色素 (Petunidin，Pt)[15-16]。

1.1 花青素的結(jié)構(gòu)

花青素的基本結(jié)構(gòu)為α-苯基苯丙吡喃陽離子，具有一個基本的C6(A環(huán))-C3(C環(huán))-C6(B環(huán)) 碳骨架結(jié)構(gòu)[17]。由于環(huán)上不同位置發(fā)生的甲基化和羥基化等修飾，主要為B環(huán)上R1和R2位置的基團不同，從而形成不同的花青素類型并呈現(xiàn)出不同的顏色 (表1)[18]。花青素的顏色隨著花青素B環(huán)上羥基的數(shù)量變化，在B環(huán)中有3’,4’,5’-OH三個取代基，飛燕草色素是通過B環(huán)3’和5’位置的羥化形成的，但多數(shù)缺乏藍色基調(diào)的花都沒有飛燕草色素。而紅色和洋紅色的花含有天竺葵基或矢車菊基的花青素，含有4’-一羥基取代基或3’,4’-二羥基取代基[19]。

1.2 花青素合成代謝途徑與相關的影響因素

1.2.1 花青素合成代謝途徑與呈色機制

花青素的生物合成途徑是研究較為成熟的苯丙氨酸類化合物途徑 (圖1)，具體的代謝途徑始于一個由苯丙氨酸經(jīng)過一系列反應合成的4-香豆酰輔酶A (4-coumaroyl-CoA) 分子與脂肪酸代謝產(chǎn)生的3個丙烯輔酶A分子 (Malonyl-CoA) 的縮合，形成黃色的查爾酮[20]，該反應由查爾酮合成酶 (Chalcone synthase，CHS) 催化。然后該途徑繼續(xù)由黃烷酮-3-羥化酶 (Flavanone-3- hydroxylase，F(xiàn)3H)，類黃酮-3’-羥化酶 (Flavanone-3’-hydroxylase，F(xiàn)3’H)和類黃酮-3’,5’-羥化酶 (Flavanone-3’5’- hydroxylase，F(xiàn)3’5’H) 催化反應，分別形成不同的無色類黃酮類產(chǎn)物，再經(jīng)二氫黃酮醇-4-還原酶(Dihydroflavonol 4 reductase，DFR) 的作用分別形成無色天竺葵素、無色矢車菊素和無色飛燕草色素[21-22]，形成的無色花青素再經(jīng)無色花青素雙加氧酶/花青素合成酶 (Leucoanthocyanidin dioxygenase/ Anthocyanidinsynthase，LDOX/ANS) 的作用形成有色的花色素。其中矢車菊色素和飛燕草色素在甲基轉(zhuǎn)移酶(-methyltransferase, OMT) 作用下，由矢車菊色素在3’位置甲基化形成芍藥色素，由飛燕草色素在5’位置甲基化形成矮牽牛色素，在3’和5’位置甲基化形成錦葵色 素[13]，最后花青素在類黃酮-3-O-糖苷轉(zhuǎn)移酶 (UDP glucose- flavonoid-3-O-glycosyltransferase，UFGT) 的作用下與一個或多個葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖等形成糖苷鍵，最終轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的花色素苷[23-24]。

表1 花青素的基本結(jié)構(gòu)式和植物體內(nèi)6種常見的花青素單體[13]

圖1 類黃酮生物合成途徑及類黃酮化合物在花卉中的積累[13, 20]

花青素苷的合成主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面進行，隨后需要有效地向液泡中轉(zhuǎn)運并貯藏，這一過程的異常也會影響植物的著色[25]?；ㄇ嗨剀盏囊号蒉D(zhuǎn)運方式主要有3種：一是在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶 (Glutathione S-transferase，GST) 的協(xié)助下經(jīng)液泡膜上的多藥耐藥抗性相關蛋白 (Multidrug resistance associated protein，MRP) 類轉(zhuǎn)運蛋白識別后將其跨膜轉(zhuǎn)運至液泡；二是由液泡膜上的多藥和有毒化合物排出家族 (Multidrug and toxic compound extrusion，MATE) 類轉(zhuǎn)運蛋白將其跨膜轉(zhuǎn)運到液泡中；三是由囊泡包裹通過膜融合的方式進入液泡。這幾種轉(zhuǎn)運機制可能同時進行，具體的作用機制尚不清楚[26-27]?；ㄇ嗨氐霓D(zhuǎn)運過程及作用機理非常復雜，金屬離子的絡合作用、液泡的pH值、溫度、光照等環(huán)境因子也會影響花青素最終的呈色，但起決定性作用的是代謝途徑中的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控因子及其互作[8, 28-29]。

1.2.2 飛燕草色素合成相關的結(jié)構(gòu)基因

在各種植物中，花青素合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因直接影響合成花青素的種類，編碼催化花青素合成過程中的各種酶，包括大多數(shù)植物中的保守基因群 (、、、、、等) 和一些植物中編碼合成不同花青素單體合成的基因群 (’、’’、、和等)，其中與飛燕草色素的合成和積累相關的基因有’、’’和[29]。在棉花中，天然彩色棉纖維的形成主要是由不同的花青素及其衍生物在纖維腔中累積而呈現(xiàn)不同色澤。Xiao等從棕色棉中克隆了、、、和等5個結(jié)構(gòu)基因，這些類黃酮合成途徑上的關鍵基因在棕色棉纖維中的表達量明顯高于在白色棉中的表達量[30]。Feng等研究表明、、和四個類黃酮合成途徑上的關鍵基因，在棕色棉纖維中的表達量明顯高于在白色棉中的表達量，HPLC分析表明柑橘素 (Naringenin)、槲皮素 (Quercetin)、莰非醇 (Kaempferol) 和楊梅素 (Myricetin) 四種黃酮類化合物在棕色纖維中的積累量明顯高于在白色棉纖維中的積累量[31]。Feng等通過對提取、分離棕色棉纖維色素物質(zhì)的NMR鑒定，發(fā)現(xiàn)棕色棉色素類物質(zhì)為原花青素，且構(gòu)成原花青素的主要結(jié)構(gòu)單元是表棓兒茶素，同時有少量的表兒茶素結(jié)構(gòu)單元，由于棕色棉纖維發(fā)育過程中，早期棕色棉的纖維是白色的，直到纖維發(fā)育到脫水時期，纖維才逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣茢噙@與原花青素的氧化聚合有關[32]。根據(jù)我們的研究，在彩色棉纖維花青素的合成代謝通路中，、和三個基因與矢車菊素和飛燕草色素的積累有密切的關系。

在花青素生物合成途徑中，和基因分別編碼合成偏紅色色調(diào)的矢車菊色素和偏藍色色調(diào)的飛燕草色素，是決定花青素種類的關鍵基因。F3’H和F3’5’H均屬于細胞色素P450單加氧酶[4, 33-34]，分別催化類黃酮B環(huán)3’-位和3’5’-位發(fā)生羥基化反應，二者競爭底物二氫莰非醇 (Dihydrokaempferol，DHK)，決定類黃酮的最終產(chǎn)物，是確定形成花色的重要步驟和關鍵酶[35]。和的表達豐度是影響花青素合成的重要因素，高豐度表達，低豐度表達，能有效合成以飛燕草色素為主的藍色系花。因在缺乏基因的植物中，飛燕草色素的合成受阻而不能形成藍色花系，所以又被稱為“藍色基因”[36]。

是合成后期表達的一個關鍵基因，和基因發(fā)揮作用后形成不同分支途徑，DFR在輔因子NADPH的作用下將第4位羰基還原為羥基，催化二氫槲皮醇(Dihydroquercetin，DHQ)、二氫莰非醇 (Dihydrokaempferol，DHK) 和二氫楊梅黃酮(Dihydromyricetin，DHM) 分別生成無色矢車菊素、無色天竺葵色素和無色飛燕草色素[37]。有研究顯示，DFR對不同底物具有選擇催化性[38]，如在矮牽牛中，DFR首先催化DHM生成無色飛燕草色素，其次是DHQ，但并不能催化DHK，因此矮牽牛不能生成天竺葵色素，而將外源的玉米基因?qū)氚珷颗?，便可以催化DHK生成天竺葵色素[39]。

因此，F(xiàn)3’H和F3’5’H活性的強弱和DFR對底物的選擇性等因素共同導致了花青素組成的改變，目前基因工程創(chuàng)制藍色花系的過程基本都是圍繞這3個酶的編碼基因進行[40]。

1.2.3 花青素合成途徑轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

植物花青素的合成與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有重要關系。目前已經(jīng)報道參與花青素合成轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的調(diào)節(jié)基因至少有3類，分別是MYB基因家族、編碼堿性螺旋-環(huán)-螺旋 (bHLH) 的基因家族 (也被稱為MYC基因家族) 和WD40基因家族。這三大家族基因形成協(xié)同調(diào)控系統(tǒng)，與結(jié)構(gòu)基因的啟動子結(jié)合來調(diào)控花青素的合成代謝，還影響許多雙子葉植物的花色素沉積[41-42]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子包含保守的DNA結(jié)合區(qū)域 (MYB結(jié)構(gòu)域)，根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的重復數(shù)不同可分成3種：含1個結(jié)構(gòu)域的R3-MYB、含2個結(jié)構(gòu)域的R2R3-MYB和含3個結(jié)構(gòu)域的R1R2R3-MYB[43-44]，其中起主要作用的是R2R3-MYB[45]。在一些雙子葉植物中，如擬南芥的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子可以獨立調(diào)控花青素生物代謝過程中早期基因的表達，不需要其他輔因子的參與，在后期則需要由MYB-bHLH-WD40轉(zhuǎn)錄因子組成的三元復合體共同調(diào)控起作用。而在玉米中花青素的整個合成途徑中，3類轉(zhuǎn)錄因子均有不同程度的參與[46]。葡萄中的R2R3-MYB調(diào)控因子會誘導等結(jié)構(gòu)基因表達量上調(diào)，使果皮中的花青素大量合成[47]。此外，將擬南芥MYB家族的基因轉(zhuǎn)入煙草中并超量表達，發(fā)現(xiàn)煙草的轉(zhuǎn)基因植株在葉片、莖和花瓣上出現(xiàn)了不同程度的紫紅色。在月季中，R2R3-MYB調(diào)控因子可激活多個結(jié)構(gòu)基因的表達，使得葉片和花瓣的花青素沉積[48]，MYB蛋白是調(diào)控發(fā)育、代謝和應答的調(diào)控網(wǎng)絡中的關鍵因子[49]。

在植物中，bHLH蛋白是第二大轉(zhuǎn)錄因子類，在調(diào)節(jié)次生代謝、細胞分化和形態(tài)建成、根中的鐵吸收和植物色素介導的光信號等過程中發(fā)揮著非常重要的作用，一般與R2R3-MYB結(jié)合起作用[50-51]。

WD40重復蛋白的結(jié)構(gòu)高度保守，是以約40個色氨酸-天冬氨酸 (W-D) 的氨基酸重復結(jié)構(gòu)WD基元，一般含有4–16個串聯(lián)重復的基元[52-53]。這類蛋白缺少DNA結(jié)合域，并不能直接識別基因的啟動子，而是其他蛋白互作的紐帶，將苦蕎麥的基因轉(zhuǎn)入煙草中，花瓣的顏色明顯加深，且和的表達量上調(diào)[54]。

研究表明，3類轉(zhuǎn)錄因子還可以結(jié)合組成一個MYB-bHLH-WD40三元復合體 (MBW復合物) 共同調(diào)控黃酮類化合物的生物合成途徑，MBW復合物主要用于調(diào)控晚期類黃酮生物合成基因，對結(jié)構(gòu)基因的激活能力比單獨的轉(zhuǎn)錄因子作用強[46, 55]。WD40蛋白通過與R2R3-MYB相互作用的bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合成穩(wěn)定MBW的復合物，而MBW復合物組成成分的多樣化會導致類黃酮的合成通路調(diào)控模式發(fā)生細微的變化。因此，MBW復合物的準確組裝也會影響黃酮類色素的產(chǎn)生、生物合成途徑基因的激活以及靶基因表達的強度[56-57]。在構(gòu)成MBW復合物的3種蛋白中，R2R3-MYB被認為直接與花青素生物合成相關的DNA靶點結(jié)合[58-59]。這些轉(zhuǎn)錄因子基因超表達可以增加花青素合成的含量，在此基礎上間接地促進飛燕草色素的合成，為基因工程和模塊化分子育種培育藍色花奠定基礎[60-61]。

1.2.4 花青素合成途徑轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是在mRNA基礎上加工、翻譯等過程中的調(diào)控，包括蛋白質(zhì)泛素化、MicroRNA (miRNA) 以及小干擾siRNA (Small interfering RNAs) 介導的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，重要光形態(tài)建成因子COP1 (Constitutively photomorphogenic 1，COP1) 和SPA (Suppressor of phyA) 通過泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng) (Ubiquitin/ 26S proteasome system，UPS) 靶向結(jié)合多個花青素苷合成的關鍵活性因子如PAP1、PAP2、HY5及其同源物 HYH抑制光誘導的花青素積累[62-63]。

呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer 酶加工后生成miRNA后，與靶基因RNA序列互補將其切割或抑制其翻譯來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控作用[64]。Yang等利用 miR828 過表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥，表明 miR828/TAS4-siR81(-)能通過抑制花青素正調(diào)控因子 PAP1、PAP2、MYB113 的表達進而負調(diào)控花青素的積累[65]。在擬南芥中控制蓮座叢與莖的連接部位花青素積累的是基因(Squamosa promoter binding protein-like 9)， SPL9 通過降低MYB-bHLH-WD40復合物穩(wěn)定性，抑制花青素合成積累，miR156能明顯抑制 SPL9表達，激活合成花青素關鍵酶基因以及轉(zhuǎn)錄因子家族基因的表達，使花青素合成增加[66-67]。

與miRNA不同，siRNA來源于雙鏈 RNA 前體，通過互補配對降解靶標轉(zhuǎn)錄本[64,68]。Morita等在雙色牽?；ㄖ袃蓚€不同的顏色區(qū)域檢測到的前體RNA，但在白色區(qū)域中卻沒有的成熟RNA，卻存在含有21個核苷酸的siRNA，可能是由于siRNA介導抑制了的表達導致了雙色牽?；ǖ某霈F(xiàn)[69]。

1.2.5 花青素苷的分子修飾

植物花青素苷B環(huán)的羥基水平越高結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定[70]，需要經(jīng)過后續(xù)的分子修飾來使其結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，分子修飾的作用因修飾的種類、數(shù)量和位置而異。糖基化能提高花青素的穩(wěn)定性和水溶性，糖基轉(zhuǎn)移酶通常將糖基轉(zhuǎn)移到花青素分子的C3位羥基上，有些糖基也會轉(zhuǎn)移到其他位置，如C5、C7位的羥基上。C3位的糖基化提高了花青素的穩(wěn)定性，雙糖苷元的穩(wěn)定性強于單糖苷元，還會將顏色稍微轉(zhuǎn)向紅色，而C5的糖基化會降低色素的強度[20, 70]。糖基化結(jié)束后才能形成顯色的花青素苷，花青素苷合成后的分子修飾增加了結(jié)構(gòu)和顏色的多樣性及穩(wěn)定性。

甲基化修飾通常發(fā)生于花青素苷的C3’和C5’位羥基上，由于甲基化替代了羥基化，羥基化的數(shù)量減少，使得最后的顏色偏紅[71]。

?；揎検够ㄇ嗨剀盏姆€(wěn)定性和水溶性更強，避免在中性或酸性溶液中褪色[72]，包括芳香族?；椭咀艴；?，其中芳香族酰基化修飾還能改變花青素的吸收波長，使其顏色向藍色轉(zhuǎn)變，且分子間的堆積力使藍色更加穩(wěn)定[71, 73-74]。

2 藍色花的分子改良途徑

與藍色相關的基因表達、轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用和花青素的分子修飾等因素都與藍色花的形成有關，結(jié)合這些影響因素，通過基因操縱的基因工程創(chuàng)制藍色花主要有以下幾種策略：其一是定量定性的控制花瓣中的內(nèi)源性黃酮類色素，其二是積累體內(nèi)非天然的飛燕草色素[9]，其三是利用轉(zhuǎn)錄因子基因調(diào)控來改良花色[75]，再者利用合成生物學技術重組生命體內(nèi)元件來改變花青素合成通路，這幾種策略均能有效改良花色[76](表2)。

2.1 控制內(nèi)源性黃酮類色素

控制內(nèi)源性黃酮類色素的策略最直接的方法是減少內(nèi)源花色素的含量，通過抑制或敲除編碼這些關鍵酶的基因，控制關鍵酶的合成，如抑制花青素代謝途徑中的、、、、等基因來減少花青素的累積，產(chǎn)生白色或淺色花。這種策略可以通過RNAi技術、反義RNA技術及基因編輯技術等方法來實現(xiàn)。此外，過表達負轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子也可以抑制花瓣中花青素的形成[89-90]。在產(chǎn)生淺色花的基礎上再導入外源基因，合成藍色飛燕草色素單體來改良藍色花卉，在控制內(nèi)源基因表達的過程中會產(chǎn)生不同的顏色，如白藍相間，這對于豐富花卉的顏色具有重要意義。

2.1.1 RNAi技術

RNAi技術是通過外源性或細胞內(nèi)源性的雙鏈RNA介導的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術干涉目標基因的表達。沉默后，目標基因的表達量一般會降低，進而影響編碼相應酶的含量。Nishihara等利用RNAi技術對龍膽的同源基因、、’’、和’’分別進行基因沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藍色花變成不同的淺色花[81-82]。

2.1.2 反義RNA技術

反義RNA技術可將目的基因的反義鏈插入表達載體中，導入植物體內(nèi)后，反向DNA轉(zhuǎn)錄的RNA與內(nèi)源的互補mRNA結(jié)合，降解或阻止其作為模板合成蛋白質(zhì)，影響關鍵酶或轉(zhuǎn)錄因子的合成從而改變花色。vander Krol等首次運用這個技術將基因的反義鏈導入矮牽牛中，抑制了花青素苷前體的合成，使得花色變淺[91]。Nakamuraet等運用反義RNA技術抑制藍色龍膽中基因的表達，得到了白色的龍膽，又用同樣的方法降低藍色矮牽牛中基因的表達量，最終花瓣顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榈{色。由于抑制上游基因會導致類黃酮類物質(zhì)的缺失，轉(zhuǎn)基因植物在抵御紫外線、逆境以及信號轉(zhuǎn)導等方面的能力大大降低，不利于植物生長發(fā)育等，因此利用該方法的研究重點轉(zhuǎn)向抑制花青素代謝通路中的下游基因[80]。

表2 基因工程改良花色的例子

2.1.3 基因編輯技術

CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 技術問世以來一直是生物界的焦點，發(fā)展至今的CRISPR/Cas9系統(tǒng)已成功用于多種生物的定向編輯和誘變，增加反向遺傳學研究手段，特別是對于具有成熟轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和已知高質(zhì)量基因組序列的植物[92-93]。Watanabe等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對日本牽牛花花青素合成途徑中的基因進行雙等位基因突變[94]。在牽?；ㄖ校?、和是一個排列整齊的三基因家族，3個基因均有表達，但基因為主要基因，是負責莖和花色素沉積的顯色基因，該基因編輯的結(jié)果顯示莖和花的顏色均變淺且花青素含量減少，后代符合遺傳規(guī)律。該研究首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實現(xiàn)了高等植物花色變化的調(diào)控。

2.2 引入外源基因合成非天然類黃酮色素

有些植物中缺少合成飛燕草色素的關鍵基因和，因此通過導入植物本身不含有的外源結(jié)構(gòu)基因使其表達產(chǎn)生飛燕草色素是一種有效獲得藍色花系的途徑。在此基礎上，將影響飛燕草色素合成的相關基因過量表達，增加飛燕草色素及衍生物的含量。選擇合適來源的基因?qū)铣赏緩接兄匾绊懀瑢⑷篮蜖颗；ǖ幕驅(qū)肟的塑?、玫瑰和菊花導致飛燕草色素的積累，檢測到三色堇’’基因比牽?；ǖ摹虍a(chǎn)生飛燕草素的效果更好[4, 85]，而且表達載體和啟動子與導入基因的有效組合也會顯著影響最終的顯色結(jié)果[95]。

培育藍色花卉，通常將控制內(nèi)源性黃酮類色素與導入外源基因合成飛燕草色素結(jié)合起來。內(nèi)源性F3’H與引入外源基因合成的F3’5’H競爭底物，為了使花瓣顏色進一步向紫色或藍色靠近，為了更好地提高飛燕草素含量，先沉默’基因，降低F3’H的含量，在此基礎上過量表達’’基因，這樣可使飛燕草色素及衍生物有效的積累[85]。

2.3 花青素合成調(diào)控相關轉(zhuǎn)錄因子的基因工程

花青素合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子的改變可能會導致植物眾多性狀的改變，包括花瓣顏色。Butelli等在番茄中導入了金魚草的和基因 (分別編碼MYB和bHLH類)，發(fā)現(xiàn)果實中的花青素含量增加，并且出現(xiàn)了紫色[96]。Han等將玉米中編碼bHLH類轉(zhuǎn)錄因子的基因和編碼MYB類轉(zhuǎn)錄因子的基因分別或共同轉(zhuǎn)入匍匐剪股穎中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在整個植株出現(xiàn)了不同程度的紫色[75]。Ohno等在對大麗花的研究中發(fā)現(xiàn)，siRNA介導的基因轉(zhuǎn)錄后基因沉默會導致大麗花呈現(xiàn)純白色[97]。

2.4 利用合成生物學創(chuàng)造藍色花卉

合成生物學是在自然界中已有生命系統(tǒng)的基礎上，重新設計和構(gòu)建生命體系，優(yōu)化自然生命[98]。已有研究證明了利用合成生物學技術可成功合成黃酮類化合物，通過在大腸桿菌或者酵母中表達一些關鍵酶基因，添加外源的前體物質(zhì)香豆酸、苯丙氨酸、肉桂酸等，可將一些常見的底物轉(zhuǎn)變?yōu)殍制に豙99]和無色花青素[100]等次級代謝產(chǎn)物[101]。Ankanahalli等利用微生物非核糖體肽合成酶 (Nonribosomal peptide synthetase，NRPS) 合成了藍色的色素苷，生成藍色玫瑰[76]。每個非核糖體肽都是由特定NRPS產(chǎn)生的，NRPS含一組特定的結(jié)構(gòu)形成一個新的生命系統(tǒng)，在連續(xù)的多步酶促過程中合成肽，參與花青素生物合成。

3 總結(jié)與展望

目前，藍色花系形成分子機理的研究比較深入，也獲得了很多跨越式的進展，利用基因工程培育出許多自然界中沒有的藍色花卉，像藍色玫瑰、康乃馨、菊花等植物已經(jīng)商業(yè)化，而且不同基因工程策略結(jié)合起來，有利于增加花卉色澤的豐富度，如產(chǎn)生白藍相間的花。

然而，進一步利用基因工程改良花色仍有很大的困難。首先，對影響飛燕草色素合成的轉(zhuǎn)錄因子所知甚少，外源基因轉(zhuǎn)入受體植物體內(nèi)，往往在一些轉(zhuǎn)錄因子的影響下，并未達到預期的效果。目前，調(diào)控花青素代謝通路的轉(zhuǎn)錄因子所知甚少，應該著重研究更多與花青素代謝有關的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。其次，還要關注轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)下游靶基因和信號通路，轉(zhuǎn)錄因子被激酶磷酸化修飾等方面，進一步了解轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制，完善花青素代謝通路中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡。第二，關于花青素苷的甲基化、?；刃揎椦芯康暮苌?，但卻是影響藍色花形成的一大因素。針對這一問題，要先對花青素苷的分子修飾進行進一步的研究，如在花青素代謝通路中，甲基化會替代羥基化，降低甲基化的修飾會反饋調(diào)控羥基化修飾，促進天竺葵色素、矢車菊色素和飛燕草色素的合成，結(jié)合其他方法累積飛燕草色素。第三，物種特異性導致了基因工程育種的進展緩慢，且結(jié)果存在著不穩(wěn)定性，不同的植物之間存在很大的差異，同一種植物轉(zhuǎn)基因后出現(xiàn)的結(jié)果也不相同。今后可加強對不同植物或同一植物不同時空花青素代謝的特異性和共性分析，并找出其共性規(guī)律和導致物種特異性的原因，利用好物種特異性來豐富花卉性狀的多樣性。第四，能高效合成飛燕草色素的基因資源很少，今后的研究應該傾向挖掘更多能形成藍色花的基因，同時也不能忽視野生藍色花卉的基因資源，在此基礎上通過人工育種建立基因資源庫很有必要。

此外，藍色花形成調(diào)控網(wǎng)絡的研究為其他植物提供了理論基礎和技術支持，包括紡織纖維材料彩色棉，彩色棉花青素合成代謝通路中包含了合成飛燕草色素的基因。目前對棉花花青素的研究也比較缺乏，而將藍色和彩色棉纖維色澤改良聯(lián)系起來，研究藍色纖維的彩色棉花尚未開展，因此研制彩棉“藍色妖姬”具有重要的研究意義和社會生產(chǎn)價值。利用分子生物學和基因工程的技術手段構(gòu)建RNAi載體對基因進行沉默使其表達量降低。還可以構(gòu)建CRISPR/Cas9載體，這樣可以避免沉默靶基因的同源序列或冗余序列的問題，定點敲除基因。同時構(gòu)建超表達載體超量表達基因使二氫莰非醇生成二氫楊梅黃酮，達到累積飛燕草色素的目的，得到轉(zhuǎn)基因植株后，篩選飛燕草色素大量累積的棉花品種。然而，藍色彩棉纖維的研制也依然存在著很大的挑戰(zhàn)，天然彩色棉纖維色素形成的生化和分子機制尚不清楚，調(diào)控彩棉纖維色素累積基因的表達和調(diào)控途徑錯綜復雜，累積色素的物質(zhì)組成與沉積機理也不明晰，飛燕草色素還要經(jīng)過復雜修飾過程和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控等。

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Progress in the genetic modification of blue flowers based on anthocyanin metabolism

Jianfang Gao, Liping Ke, and Yuqiang Sun

Laboratory of Plant Genome and Colored Fiber Molecular Improvement, School of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-TechUniversity, Hangzhou 310018, Zhejiang, China

As water-soluble, natural pigments, anthocyanins are responsible for the red, purple and blue colors of many flowers, which attract pollinators to spread pollen. The colors of flowers are also essential for plants to survive in the nature and become one of the most significant characteristics of ornamental plants. In the booming floriculture industry, to produce various flower colors could increase the richness of natural colors, but it is still difficult to breed flowers with coveted blue color. The diversity of flower color is mainly determined by the types and contents of anthocyanins and their derivatives. The synthesis of delphinidin pigments is the key factor for breeding blue flowers. However, there are no structural genes in many plants to biosynthesize delphinidin pigments. Blue flowers are successfully created by genetic engineering in recent years. In this paper, using common ornamental plants as examples, we review the mechanism of plant flower coloration from the aspects of the key factors affecting the synthesis of delphinidin pigment and the production strategies of blue flowers based on the regulation of anthocyanin metabolism. Different strategies of molecular breeding could provide opportunities to improve colors of other floriculture plants and to develop anthocyanin-rich economic crops, such as colored cotton with blue fibers.

genetic engineering, flower color improvement, bluish flower, anthocyanin

July 25, 2019;

October 11, 2019

Supported by: National Key Research and Development Program of China (No. 2018YFD0100401), National Natural Science Foundation of China (No. 31671738).

Yuqiang Sun. Tel: +86-571-86843335; Fax: +86-571-86843303; E-mail: sunyuqiang@zstu.edu.cn

國家重點研發(fā)計劃(No. 2018YFD0100401)，國家自然科學基金(No. 31671738) 資助。

10.13345/j.cjb.190335

2019-10-30

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20191030.0956.002.html

高建芳, 柯麗萍, 孫玉強. 基于花青素代謝培育藍色花卉的研究進展. 生物工程學報, 2020, 36(4): 678–692.

Gao JF, Ke LP, Sun YQ. Progress in the genetic modification of blue flowers based on anthocyanin metabolism. Chin J Biotech, 2020, 36(4): 678–692.

(本文責編 陳宏宇)