柴里昂，樊懷福，劉晨，杜長(zhǎng)霞

·綜 述·

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

柴里昂，樊懷福，劉晨，杜長(zhǎng)霞

浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300

黃瓜是世界性的重要蔬菜作物。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是研究植物基因功能及品種改良的重要手段。為進(jìn)一步加快黃瓜的轉(zhuǎn)基因研究和育種進(jìn)程，文中針對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化方法，從黃瓜再生能力的影響因素、遺傳轉(zhuǎn)化條件和過(guò)程中各類添加物質(zhì)等方面，闡述了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展及存在的問(wèn)題，并對(duì)提高黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率和安全篩選標(biāo)記的應(yīng)用等前景進(jìn)行了展望，以期為黃瓜抗逆育種和果實(shí)品質(zhì)改良等研究提供參考。

黃瓜，轉(zhuǎn)基因，再生能力，遺傳轉(zhuǎn)化效率

黃瓜作為世界上重要的蔬菜作物之一，其基因功能研究和遺傳育種工作受到了廣泛關(guān)注。農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是一種天然的植物轉(zhuǎn)基因體系，借助農(nóng)桿菌侵染受傷植物體，將經(jīng)過(guò)改造的T-DNA區(qū)插入到植物的基因組，再通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株，具有穩(wěn)定性好、成本低、技術(shù)簡(jiǎn)單、設(shè)備要求不高等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為黃瓜基因研究與品種改良的重要手段[1]。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)是目前應(yīng)用最成熟、最廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化方法。依靠黃瓜的離體再生體系，輔以適當(dāng)?shù)奶砑游镔|(zhì)，創(chuàng)建適宜黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化條件是此項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵，一般包括無(wú)菌外植體的獲取、預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)、抗性芽誘導(dǎo)篩選、抗性芽伸長(zhǎng)及生根、煉苗移栽等階段。黃瓜的組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)[2-3]，通過(guò)后續(xù)研究者們不斷改良優(yōu)化，在抗生物脅迫[4-5]、抗非生物脅迫[6-7]、果實(shí)品質(zhì)改良[8-9]、生長(zhǎng)發(fā)育[10-11]等基因的遺傳轉(zhuǎn)化工作中取得了豐碩的成果。但是，黃瓜因基因型、外植體類型等因素不同，導(dǎo)致再生能力差異仍較大，關(guān)于遺傳轉(zhuǎn)化的條件研究仍不夠全面，在黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中各種添加物質(zhì)的原理及作用研究仍不夠徹底，以至褐化、污染、玻璃苗、老小苗、遺傳轉(zhuǎn)化效率低、基因表達(dá)和遺傳不穩(wěn)定等問(wèn)題目前仍困擾著研究者們。文中從黃瓜離體再生的能力、遺傳轉(zhuǎn)化條件及過(guò)程中的各類添加物質(zhì)出發(fā)，分析和總結(jié)當(dāng)前已有的進(jìn)展與成果，為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)黃瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)的深入研究及未來(lái)發(fā)展提供參考。

1 影響黃瓜再生能力的因素

高再生能力是成功遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，黃瓜的離體再生主要有直接通過(guò)培養(yǎng)外植體獲得不定芽和通過(guò)先誘導(dǎo)愈傷組織再誘導(dǎo)出不定芽?jī)煞N方式。兩種方式在培養(yǎng)步驟上基本相同，差別在于直接誘導(dǎo)不定芽的方式具有再生周期短、再生率高等特點(diǎn)，而通過(guò)誘導(dǎo)愈傷組織再誘導(dǎo)不定芽的方式更利于后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性篩選[4]。影響黃瓜再生能力的主要因素有以下幾方面。

1.1 品種基因型

不同品種的黃瓜再生能力差異較大。Todd等[3]對(duì)85個(gè)黃瓜品種進(jìn)行了離體再生實(shí)驗(yàn)，但僅有28個(gè)品種可以從子葉再生成芽，證明了不同黃瓜基因型再生能力差異較大。不僅如此，即使是容易再生的不同基因型黃瓜品種，其再生能力也存在顯著差異[12]，如有研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜品種‘吉林旱瓜’再生頻率可達(dá)97%，而黃瓜品種‘9910 Gt’僅有67%[13]，同時(shí)指出無(wú)論是外植體平均再生芽數(shù)，還是出苗和生長(zhǎng)分化速度，在相同的培養(yǎng)條件下，‘吉林旱瓜’都明顯快于其他5個(gè)品種，目前許多研究都得出了類似規(guī)律[14-16]。Wang等[17]通過(guò)QTL定位和SNP分子標(biāo)記技術(shù)，發(fā)現(xiàn)基因(，參與響應(yīng)脫落酸調(diào)節(jié)、分生組織再生和質(zhì)膜H+-ATP酶活性調(diào)節(jié)等) 在黃瓜離體再生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，首次在遺傳機(jī)制中證實(shí)了不同品種黃瓜再生能力的差異性。合適的基因型再生能力強(qiáng)，生長(zhǎng)分化迅速、一致，對(duì)逆境的適應(yīng)性強(qiáng)，可有效減少再生植株在組培微環(huán)境中的污染影響和有害物質(zhì)的積累。

1.2 外植體選擇

黃瓜再生芽需通過(guò)切取的外植體分化而來(lái)，研究中主要針對(duì)苗齡、苗態(tài)和選擇不同的外植體類型來(lái)優(yōu)化黃瓜離體再生體系。

研究中多以1–4 d為黃瓜最佳苗齡[18-20]，也有選擇5–7 d作為最佳苗齡[21]，在苗態(tài)上多選擇子葉抱合未完全展開(kāi)[6,22]、子葉直立完全展開(kāi)[21]和未經(jīng)過(guò)光照培養(yǎng)的短苗齡子葉[10,18]。苗齡既是影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量、活力、分裂率、植物體激素水平、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量等的主要因素，又決定著黃瓜組培苗的苗態(tài)，研究中可能因種子活力或浸種方式的差異，導(dǎo)致黃瓜種子萌發(fā)速率不同，進(jìn)而影響黃瓜組培苗達(dá)到最佳再生狀態(tài)的苗齡不同[23]，因此，以苗態(tài)作為最佳再生效率的主要參考因素更為合理。

外植體類型主要有子葉、子葉節(jié)、下胚軸、上胚軸等，其中使用最多的為子葉[6,24]和子葉節(jié)[25-27]，再生頻率分別能達(dá)到96.7%[9]和100%[28]，而胚軸再生頻率僅有21%[26]，明顯低于子葉及子葉節(jié)，造成這種差異的原因可能主要受基因型影響，另外外植體的處理方法、培養(yǎng)環(huán)境等其他因素也對(duì)不同外植體的再生能力有一定影響。以子葉、子葉節(jié)和胚軸為外植體，均有成功獲得轉(zhuǎn)基因植株的報(bào)道，但有研究證實(shí)，子葉和子葉節(jié)的轉(zhuǎn)基因效率高于胚軸[29]。綜合來(lái)看，最適宜黃瓜離體再生的外植體類型為子葉節(jié)或子葉[30-31]。

2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)黃瓜轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化條件

2.1 預(yù)培養(yǎng)條件

普遍認(rèn)為，通過(guò)預(yù)培養(yǎng)可以調(diào)整外植體內(nèi)源激素水平、植物體細(xì)胞生理狀態(tài)，減輕逆境對(duì)幼嫩外植體的脅迫，促進(jìn)細(xì)胞分裂和外源基因的整合[32]，且預(yù)培養(yǎng)一般以暗培養(yǎng)的方式進(jìn)行，對(duì)于調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶活性增速等有顯著影響[33]。根據(jù)不同預(yù)培養(yǎng)天數(shù)后的抗性芽出芽率[21]和GUS瞬時(shí)性表達(dá)率[34]發(fā)現(xiàn)，不同的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率影響顯著[32]，1–2 d是多數(shù)研究中選用的預(yù)培養(yǎng)天數(shù)[10,35]，分析指出，外植體在過(guò)短的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)無(wú)法達(dá)到最佳的生理狀態(tài)，過(guò)長(zhǎng)的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間會(huì)使外植體傷口愈合，農(nóng)桿菌侵染的效果會(huì)大大降低，進(jìn)而影響遺傳轉(zhuǎn)化效率。

2.2 侵染條件

利用預(yù)制的侵染液侵染受傷的外植體是黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中的重要步驟[36]。農(nóng)桿菌GV3101[8]、LBA4404[37]、EHA105[38]等菌株在黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化的研究中都有報(bào)道使用，且都成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，將含有目標(biāo)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌培養(yǎng)至菌液600值為0.6–0.8后，再將其重懸稀釋至600值為0.2–0.3，研究認(rèn)為，培養(yǎng)液600值在0.6至0.8間，農(nóng)桿菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)農(nóng)桿菌活力最高，稀釋后600值在0.2至0.3間，可避免過(guò)高濃度的農(nóng)桿菌使外植體腐化死亡[6-8]。外植體的侵染方式主要為浸泡侵染[4,10]，也有利用真空負(fù)壓等其他設(shè)備提高侵染深度的方法被報(bào)道[39-40]，楊麗[39]在研究中使用綠色熒光蛋白監(jiān)測(cè)了不同侵染條件下的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程，發(fā)現(xiàn)再生位點(diǎn)與侵染位點(diǎn)并不一致，侵染比率只有30%，在改為真空負(fù)壓侵染后，侵染比率提高到了90%。侵染時(shí)間雖受限于侵染方式，但大多介于10–30 min[14,41]之間，侵染時(shí)間低于10 min[32]或超過(guò)30 min[42]的報(bào)道并不多見(jiàn)。

2.3 共培養(yǎng)條件

共培養(yǎng)階段設(shè)置在外植體被侵染之后，是目標(biāo)基因整合進(jìn)入植物染色體的重要階段，共培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短需根據(jù)外植體耐受力、侵染液濃度和共培養(yǎng)操作方式的差異進(jìn)行選優(yōu)，許多研究以抗性芽出愈率或GUS陽(yáng)性表達(dá)量，選擇最佳共培養(yǎng)時(shí)間在2–4 d內(nèi)[34,39]。針對(duì)共培養(yǎng)溫度的研究發(fā)現(xiàn)，不能僅考慮黃瓜外植體分化、農(nóng)桿菌生長(zhǎng)或是T-DNA轉(zhuǎn)移的最佳溫度，還需考慮共培養(yǎng)溫度與共培養(yǎng)時(shí)間之間的互作關(guān)系，在共培養(yǎng)2 d時(shí)，26 ℃更利于遺傳轉(zhuǎn)化[42]。關(guān)于共培養(yǎng)基pH對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)基pH在5.0–5.2間更有利于抗性芽率的提高[38]，有認(rèn)為是因?yàn)樘砑觿┮阴６∠阃?Acetosyringone，AS) 在偏酸性環(huán)境下作用效果更好，也有認(rèn)為較低的pH利于農(nóng)桿菌Vir基因的活化、轉(zhuǎn)移和表達(dá)。隨著共培養(yǎng)時(shí)間、溫度、培養(yǎng)基pH等條件的研究日趨完善，對(duì)于提高根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率具有重要意義。

本課題組在研究中首先使用1/2MS液體培養(yǎng)基洗脫共培養(yǎng)結(jié)束的外植體3次，再將外植體吹干轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)可大大減少篩選培養(yǎng)階段農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)量和抑菌抗生素的使用量，與未處理組相比，抗性芽率提高至67%，這種洗脫農(nóng)桿菌的方法對(duì)外植體正常生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，下一步將對(duì)洗脫時(shí)間、抗生素添加量及對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響等因素作進(jìn)一步研究。

3 添加劑在黃瓜轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用

3.1 植物激素

研究發(fā)現(xiàn)，被切下的外植體的內(nèi)源激素含量在不同再生時(shí)期劇烈變化，且在愈傷誘導(dǎo)階段脫落酸(Abscisic acid，ABA) 的含量顯著增加，ABA/吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA) 和ABA/赤霉素(Gibberellin，GA) 含量也與愈傷誘導(dǎo)時(shí)期存在關(guān)聯(lián)[43]，說(shuō)明外植體在離體再生的各個(gè)過(guò)程中，各種植物激素的含量發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，因此研究者們采用在黃瓜離體再生的不同階段添加不同濃度不同植物激素組合的方式來(lái)篩選最適激素組合[40]，其中被廣泛應(yīng)用的兩種植物激素是6-芐氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA) 和ABA (表1)，也有使用GA、IAA、吲哚丁酸、萘乙酸等的報(bào)道。6-BA的濃度范圍多在0.5–2.0 mg/L，ABA的濃度范圍在0–2.0 mg/L。根據(jù)黃瓜基因型、外植體類型和離體再生階段的不同，已有研究完善了津優(yōu)系列[11,18]、津研系 列[7,24]、‘新泰密刺’[4,37]、‘9930’[17,19]等黃瓜品系的離體再生最佳激素組合，并獲得了最高100%的再生頻率(表1)[19]。本課題組在誘導(dǎo)‘新泰密刺’外植體直接分化出芽的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)0.5 mg/L 6-BA與1.0 mg/L ABA搭配使用效果最佳。

不定芽誘導(dǎo)完成后，外植體內(nèi)源激素逐漸趨于穩(wěn)定，研究中多采用下調(diào)所添加的植物激素濃度、改變或減少所使用激素的種類，以促進(jìn)再生芽的伸長(zhǎng)[20,22]，此步驟周期在7–15 d左右。當(dāng)再生苗伸長(zhǎng)至2 cm左右時(shí)即可開(kāi)始誘導(dǎo)生根，有研究中添加少量的植物激素促進(jìn)再生芽生根[10,15]，但一般認(rèn)為不需要添加植物激素即可誘導(dǎo)生根[16,18]，這可能與黃瓜再生芽比較容易誘導(dǎo)生根有關(guān)[4]。

3.2 AgNO3

在黃瓜離體再生過(guò)程中AgNO3被廣泛用作添加劑，研究認(rèn)為Ag+在促進(jìn)外植體分化、生長(zhǎng)和防止褐化等方面有顯著作用，這與Ag+抑制乙烯合成量呈正相關(guān)，而乙烯合成抑制外植體再生有關(guān)[44]，一般認(rèn)為添加0.5–2.0 mg/L AgNO3即可達(dá)到最佳效果，過(guò)高的使用量反而會(huì)起到反作 用[13,31]，但也有研究中不使用AgNO3仍可獲得較高的再生頻率(表1)，并保持再生芽良好的生長(zhǎng)狀態(tài)[5]，這可能是因?yàn)榛蛐?、外植體有所差異，導(dǎo)致外植體抗逆性不同。在研究中，AgNO3的最佳添加濃度還需要進(jìn)一步篩選。

表1 植物激素及AgNO3在不同黃瓜品種外植體芽誘導(dǎo)階段的應(yīng)用

3.3 AS及抗氧化劑

許多研究在遺傳轉(zhuǎn)化的預(yù)培養(yǎng)[23]、侵染、共培養(yǎng)階段中添加一定濃度的AS[18-19]，發(fā)現(xiàn)AS對(duì)提高抗性芽分化率有顯著效果，這是因?yàn)锳S等酚類物質(zhì)具有活化農(nóng)桿菌Vir區(qū)、促進(jìn)外源基因?qū)胫参锘蚪M、進(jìn)而提高遺傳轉(zhuǎn)化效率的作用[4,35]。共培養(yǎng)基中AS濃度最低為20 μmol/L[19]，最高 為150 μmol/L[32]，侵染液中AS濃度多使用 100 μmol/L[18,42]，盡管在添加階段和使用濃度上存在差異，但都表明酚類物質(zhì)對(duì)黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化具有促進(jìn)作用。也有研究通過(guò)抑制酚類物質(zhì)的氧化即添加抗氧化劑的方法來(lái)提高遺傳轉(zhuǎn)化效率，如α-辛硫酸[16]、L-Cystine、二硫蘇糖醇、Na2S2O3[35]等，抗氧化劑在其他植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用較為多見(jiàn)且效果良好[16]，但在黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用并不廣泛。無(wú)論是直接添加AS，還是添加抗氧化劑，都是以提高酚類物質(zhì)含量來(lái)提高遺傳轉(zhuǎn)化效率，但該類物質(zhì)常以有毒有機(jī)溶劑溶解，或本身在高濃度下會(huì)有一定的毒害作用，并與侵染液種類[41]、共培養(yǎng)基pH[38]、共培養(yǎng)溫度[42]等因素易形成交互作用，具體的添加階段和添加濃度還需要進(jìn)一步探討。

3.4 抗生素

在黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的篩選培養(yǎng)階段，常以篩選抗生素和抑菌抗生素配合使用。卡那霉素(Kanamycin，Kan)[16,40]、潮霉素[10,32]、草甘膦[25]等是使用最多的篩選標(biāo)記，普遍認(rèn)為，黃瓜外植體的篩選抗生素耐受壓力與基因型[19,28]和培養(yǎng)階段[20,26]關(guān)系密切，如黃瓜‘川綠2號(hào)’在140 mg/L的Kan濃度下仍不能完全抑制出芽，而‘白絲條’和‘二旱子’在40 mg/L和60 mg/L的濃度下便能完全抑制出芽[42]，黃瓜‘S06’在芽誘導(dǎo)階段臨界Kan濃度為140 mg/L，而在生根階段100 mg/L的Kan即可完全抑制生根[20]。篩選抗生素濃度既不能太高，又不能太低，過(guò)高的濃度易使幼嫩的植物體或未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞死亡，過(guò)低的濃度會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性率過(guò)高，大大增加后期陽(yáng)性鑒定的工作量。近些年研究者們偏向設(shè)定梯度濃度來(lái)進(jìn)行陽(yáng)性篩選[26]，即在誘導(dǎo)出芽時(shí)使用低濃度的篩選抗生素，在壯芽及生根階段使用較高的篩選濃度，這種根據(jù)基因型和培養(yǎng)階段的改變而進(jìn)行的動(dòng)態(tài)篩選能有效解決過(guò)低或過(guò)高的篩選濃度引起的問(wèn)題。

不同于篩選抗生素對(duì)于外植體分化抑制效果明顯，抑菌抗生素常選用對(duì)植物體傷害較小而具有一定抑制農(nóng)桿菌作用的抗生素，常用的抑菌抗生素有羧芐青霉素(Carbenicillin，Carb)、頭孢噻肟鈉(Cefotaxime sodium，Cef)、特美汀(Timentin, TM)、氨芐西林等[32,36]，雖然這些抗生素都可以有效抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，但往往使用的濃度較高，通常在300–500 mg/L，對(duì)于外植體的分化、生長(zhǎng)也有一定的影響。在一些報(bào)道中發(fā)現(xiàn)Cef相較于Carb更利于愈傷誘導(dǎo)和出芽[26,32]，TM是一種新型抑制農(nóng)桿菌的抗生素，最大的特點(diǎn)是抑菌持續(xù)性強(qiáng)，在70 d內(nèi)都可有效抑菌[45]，但使用成本要比Cef等高出許多。因此在黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中可根據(jù)不同培養(yǎng)階段和周期，選擇最適宜的抑菌抗生素，如在分化誘導(dǎo)階段選擇對(duì)外植體和愈傷誘導(dǎo)影響較小的種類，在壯芽或生根等生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)的階段選擇抑菌效果顯著且持久的種類，并且在使用濃度上，可根據(jù)污染情況適當(dāng)調(diào)高或降低，使遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中外植體受到農(nóng)桿菌和抗生素的影響降到最低。

基于前人的研究成果[46]，本課題組在試驗(yàn)中將活性炭作為外源添加物質(zhì)應(yīng)用在黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)添加活性炭的培養(yǎng)基可保持較長(zhǎng)時(shí)間無(wú)色透明狀，而未添加活性炭的培養(yǎng)基在一周左右會(huì)逐漸變黃，并且發(fā)現(xiàn)活性炭在0.5%的質(zhì)量濃度作用下，對(duì)抑制褐化和促進(jìn)生根方面作用顯著，但具體的添加階段和對(duì)培養(yǎng)基原有物質(zhì)的吸附作用還有待進(jìn)一步研究。

4 討論及展望

黃瓜是目前公認(rèn)較難進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的物種，已有報(bào)道中經(jīng)PCR、Southern blotting、qPCR等方法檢測(cè)后，遺傳轉(zhuǎn)化效率最高可達(dá)29%[47]，而最低僅有0.1%[48]，大多在1%–10%之間，并且無(wú)法穩(wěn)定遺傳給下一代，常出現(xiàn)基因丟失或沉默現(xiàn) 象[5]。農(nóng)桿菌侵染位點(diǎn)與外植體再生位點(diǎn)不一致是造成黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率低的重要原因[48]，各階段培養(yǎng)時(shí)間、溫度、培養(yǎng)基pH值、侵染方式、菌株及載體類別等是影響侵染位點(diǎn)深度的主要因素，但在已有研究中這些參數(shù)都有所差異，且缺乏足夠的細(xì)節(jié)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基、固化劑[16]、組織培養(yǎng)光環(huán)境和氣體環(huán)境、再生植株馴化等方面的研究較少，農(nóng)桿菌污染嚴(yán)重和轉(zhuǎn)基因植株在馴化階段死亡也是導(dǎo)致黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率低的另一重要原因。目前各類抗生素仍是黃瓜轉(zhuǎn)基因體系中的主要篩選標(biāo)記，雖有如甘露糖[49]等的安全篩選標(biāo)記被報(bào)道用于黃瓜轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，但發(fā)展較為緩慢[50]，與傳統(tǒng)的抗生素篩選標(biāo)記相比仍有很大的研究空間。

隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，黃瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷優(yōu)化，研究者們對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行了積極的探索。超聲波、真空泵等工具的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[41]，活體轉(zhuǎn)染[50]、新型納米顆粒介導(dǎo)[51]等方法也逐漸進(jìn)入研究者們的視線，可以預(yù)見(jiàn)，黃瓜的離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系會(huì)越來(lái)越完善，CRISPR/Cas9技術(shù)[48]及安全篩選標(biāo)記會(huì)越來(lái)越多地應(yīng)用于無(wú)抗生素的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化研究上，一些目前難以突破的問(wèn)題會(huì)隨著研究的深入得以解決。

[1] Zhang ZX, Li X, Ma S, et al. A protocol for-mediated transformation of cucumber (L.) from cotyledon explants. Plant Biotechnol Rep, 2017, 9(6): 405–416.

[2] Sato M, Imanishi S, Hiura I.plantlet formation from hypocotyl and hypocotyl callus ofL. Jpn J Breed, 1979, 29(1): 33–38.

[3] Wehner TC, Locy R.adventitious shoot and root formation of cultivars and lines ofL. Hort Sci, 1981, 16(6): 759–760.

[4] Wang Y, Gu XF, Zhang SP, et al. Transformation of RNAi vector in cucumber ()by-mediated transfection. Bull Bot, 2014, 49(2): 183–189 (in Chinese). 王燁, 顧興芳, 張圣平, 等. RNAi載體導(dǎo)入黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化體系. 植物學(xué)報(bào), 2014, 49(2): 183–189.

[5] Ren DL, Chen FF, Wang H, et al. Construction of expression vector of defense genesfrom cucumber and its genetic transformation research. Acta Agric Bor-Occid Sin, 2017, 26(2): 255–261 (in Chinese). 任丹莉, 陳菲帆, 王暉, 等. 黃瓜基因表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(2): 255–261.

[6] Pan LL. Cloning, transformation and functional analysis under NO3-stress ofgene in cucumber[D]. Tai’an: Shandong Agricultural University, 2017 (in Chinese). 潘玲玲. 黃瓜基因的克隆、遺傳轉(zhuǎn)化及在硝酸鹽脅迫下的功能分析[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2017.

[7] Liu Y. Study on transfer ofgene by grobacterium mediation into cucumber[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2016 (in Chinese). 劉艷. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的谷氧還蛋白基因?qū)S瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2016.

[8] Tang HY. Genetic transformation and functional analysis of the gene controlling white immature fruit skin color in cucumber[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2018 (in Chinese). 唐紅鈺. 黃瓜白果皮顏色基因遺傳轉(zhuǎn)化與功能分析[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2018.

[9] Liu HQ. A modified protocol of-mediated transformation and Map-based cloning and functional analysis ofgene controlling white immature fruit color in cucumber[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2018 (in Chinese). 劉漢強(qiáng). 黃瓜高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和嫩果白皮基因的圖位克隆與功能分析[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2018.

[10] Liu PP, Jiang ZS, Wang ML, et al. Expression vector construction of Rubisco activase geneand genetic transformation to cucumber. Acta Hortic Sin, 2012, 39(5): 869–878 (in Chinese).劉培培, 姜振升, 王美玲, 等. 黃瓜Rubisco活化酶基因表達(dá)載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化. 園藝學(xué)報(bào), 2012, 39(5): 869–878.

[11] Ni L. Genetic transformation of cucumber (L.) using RNAi vector withgene[D]. Xinxiang: Henan Institute of Science and Technology, 2017 (in Chinese).倪蕾.基因RNAi干擾載體導(dǎo)入黃瓜的研究[D]. 新鄉(xiāng): 河南科技學(xué)院, 2017.

[12] Du SL, Wei HJ, Wei AM, et al. Effects of seedling stage, genotype and explant type onsomatic organogenesis of cucumber. TianjinAgric Sci, 2000, 6(4): 1–5 (in Chinese).杜勝利, 魏惠軍, 魏愛(ài)民, 等. 苗齡、基因型和外植體類型對(duì)黃瓜離體器官發(fā)生的影響. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué), 2000, 6(4): 1–5.

[13] Zhang RW, Gu XF, Wang Y, et al. Regeneration system establishment from cotyledons in different cucumber (L.) genotypes. ActaAgric Bor-Sin, 2010, 25(S1): 50–54 (in Chinese).張若緯, 顧興芳, 王燁, 等. 不同黃瓜基因型子葉再生體系的建立. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2010, 25(S1): 50–54.

[14] An YW. Study on regeneration and genetic transformation in cucumber (L.)[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2013 (in Chinese).安亞偉. 黃瓜離體再生與遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[D]. 揚(yáng)州: 揚(yáng)州大學(xué), 2013.

[15] Ding F. Research on influence factors ofregeneration of cucumber[D]. Hefei: Anhui Agricultural University, 2014 (in Chinese). 丁飛. 黃瓜離體再生的影響因素研究[D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[16] Li L, Meng YJ, Zhang L, et al. Study on optimization of-mediated transformation system of cucumber. ActaAgric Bor-Sin, 2015, 30(5): 115–121 (in Chinese).李蕾, 孟永嬌, 張璐, 等. 黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化的研究. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2015, 30(5): 115–121.

[17] Wang Y, Zhou GT, Zhu SH, et al. Genetic analysis and identification of a candidate gene associated withregeneration ability of cucumber. Theoret Appl Genet, 2018, 131(12): 2663–2675.

[18] Li YH. Establishment of regeneration system and-mediated genetic transformation protocol in cucumber (L.)[D]. Xinxiang: Henan Institute of Science and Technology, 2016 (in Chinese).李艷華. 黃瓜離體再生和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與優(yōu)化[D]. 新鄉(xiāng): 河南科技學(xué)院, 2016.

[19] Wu Z. Establishment of regenerationand genetic transformation system in cucumber (L.)[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2012 (in Chinese).吳振. 黃瓜離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[20] Wang YR, Chen LM, Pan JS, et al. Establishment of high effective regeneration system in cucumber (L.) andmediated genetic transformation. J Shanghai Jiaotong Univ: Agric Sci, 2006, 24(2): 152–156, 164 (in Chinese).王艷蓉, 陳麗梅, 潘俊松, 等. 黃瓜子葉高效再生體系的建立與遺傳轉(zhuǎn)化. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào): 農(nóng)業(yè)科學(xué)版, 2006, 24(2): 152–156, 164.

[21] Jia JS, Si LT, Han GC, et al. Regenerationand its influential factors of cucumber (L.). J Henan Agric Sci, 2008, 31(6): 99–102 (in Chinese).賈金生, 司龍亭, 韓貴超, 等. 不同基因型黃瓜離體再生及其影響因素的研究. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 31(6): 99–102.

[22] Zhong HL, Li YH, Chen XL, et al. Optimization of regeneration system inL. Chin Agric Sci Bull, 2015, 31(10): 80–86 (in Chinese).鐘輝麗, 李玉紅, 陳雪琳, 等. 黃瓜離體器官再生體系的優(yōu)化. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2015, 31(10): 80–86.

[23] Bie BB, Huang DM, Pan JS, et al. Effects of seedling stages on regeneration from cotyledonary node of cucumber (L.) and genetic transformation efficiency. J Shanghai Jiaotong Univ: Agric Sci, 2013, 31(6): 55–60 (in Chinese).別蓓蓓, 黃東梅, 潘俊松, 等. 不同苗態(tài)對(duì)黃瓜子葉節(jié)離體再生及遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào): 農(nóng)業(yè)科學(xué)版, 2013, 31(6): 55–60.

[24] Huang YL, Yin KD, Yue CJ. Optimum combination of hormone concentration during callus subculture of cucumber. Acta Laser Biol Sin, 2014, 23(1): 83–89 (in Chinese).黃玉蘭, 殷奎德, 岳才軍. 黃瓜愈傷組織繼代培養(yǎng)中激素濃度組合的優(yōu)化. 激光生物學(xué)報(bào), 2014, 23(1): 83–89.

[25] Liu CH. Identification and functional analysis of the Propamcarb-related genein cucumber[D]. Harbin: Northeast Agricultural University, 2017 (in Chinese).劉春紅. 黃瓜低霜霉威殘留性相關(guān)基因的鑒定及功能分析[D]. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2017.

[26] Zhang SJ. Studies on regeneration andgentic transformation of cucumber (L.)[D]. Taian: Shandong Agricultural University, 2011 (in Chinese).張守杰. 黃瓜再生體系的建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[27] Yang LM, Liu HQ, Zhao JY, et al.() encodes a WD40 repeat domain-containing protein associated with organ size variation in cucumber. Plant J, 2018, 95(5): 834–847.

[28] Du YL, Zhao XT, Su F. Induction of two genotypes cucumber callus. Northern Hortic, 2016, (11): 96–99 (in Chinese).都彥伶, 趙新濤, 宿烽. 兩種基因型黃瓜愈傷組織的誘導(dǎo). 北方園藝, 2016, (11): 96–99.

[29] Kose E, Ko? NK.transformation of cucumber (L.) and plant regeneration. Biotechnol Biotechnol Equip, 2014, 17(2): 56–62.

[30] Hou AJ, Zhu YM, Yang AF, et al. Main factors influencing the frequency of direct organogenesis of cucumber. Acta Hortic Sin, 2003, 30(1): 101–103 (in Chinese).侯愛(ài)菊, 朱延明, 楊愛(ài)馥, 等. 誘導(dǎo)黃瓜直接器官發(fā)生主要影響因素的研究. 園藝學(xué)報(bào), 2003, 30(1): 101–103.

[31] Chang HC, Ni L, Sun YD, et al. Factors influencing-mediated genetic transformation of cucumber. Northern Horticult, 2018, (2): 9–14 (in Chinese).常懷成, 倪蕾, 孫涌棟, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素. 北方園藝, 2018, (2): 9–14.

[32] Xu N, Chu J, Xia HW, et al. Establishment of genetic transformation system of cucumber ‘’. J Trop Subtrop Botany, 2010, 18(6): 679–684 (in Chinese).許娜, 儲(chǔ)俊, 夏海武, 等. 黃瓜‘新津春四號(hào)’遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2010, 18(6): 679–684.

[33] Wang Y, Gu XF, Zhang SP. Effect of dark culture on enzyme and soluble protein variance during cucumber cotyledon node regeneration. Acta Botan Bor-Occid Sin, 2011, 31(9): 1793–1798 (in Chinese).王燁, 顧興芳, 張圣平. 暗培養(yǎng)對(duì)黃瓜子葉節(jié)再生頻率及其相關(guān)酶活性和可溶性蛋白含量的影響. 西北植物學(xué)報(bào), 2011, 31(9): 1793–1798.

[34] Huang DM, Bie BB, Pan JS, et al. Optimum for regeneration and transformation system inL. J Shanghai Jiaotong Univ: Agric Sci, 2012, 30(2): 42–47 (in Chinese).黃東梅, 別蓓蓓, 潘俊松, 等. 黃瓜(L.)離體再生和轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào): 農(nóng)業(yè)科學(xué)版, 2012, 30(2): 42–47.

[35] Wang Y, Gu XF, Zhang SP, et al. Influence of Lipoic acid on transformation of cucumber cotyledonby. ActaAgric Bor-Sin, 2012, 27(S1): 51–56 (in Chinese).王燁, 顧興芳, 張圣平, 等. 硫辛酸對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化的影響. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2012, 27(S1): 51–56.

[36] Nanasato Y, Konagaya KI, Okuzaki A, et al. Improvement of-mediated transformation of cucumber (L.) by combination of vacuum infiltration and co-cultivation on filter paper wicks. Plant Biotechnol Rep, 2013, 7(3): 267–276.

[37] Lü JG. Suppression of cucumber stachyose synthase gene () inhibits phloem loading and reduces low temperature stress tolerance[D]. Beijing: China Agricultural University, 2017 (in Chinese).呂建國(guó). 抑制黃瓜水蘇糖合成酶基因降低韌皮部裝載和低溫脅迫耐受性[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2017.

[38] Ning Y, Li L, Miao YM, et al. Influence of Acetosyringone concentration and pH of co-culture medium on efficiency of cucumber genetic transformation. China Cucurbits Vegetables, 2013, 26(5): 6–9 (in Chinese).寧宇, 李蕾, 苗永美, 等. 乙酰丁香酮及共培養(yǎng)pH對(duì)黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響. 中國(guó)瓜菜, 2013, 26(5): 6–9.

[39] Yang L. Engineering Non-transgenic gynoecious cucumber using an improved transformation protocol and optimized CRISPR/Cas9 system[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2018 (in Chinese).楊麗. 建立黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯技術(shù)體系以創(chuàng)制黃瓜全雌系種質(zhì)材料[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2018.

[40] Wang SL, Ku SS, Ye XG, et al. Current status of genetic transformation technology developed in cucumber (L.). J Integr Agric, 2015, 14(3): 469–482.

[41] Wu JY, Liu JG, Ma XR, et al. Obtain the transgenic cucumber of the fusion gene of region A ofgene of streptococcus mutans and B subunit of Cholera toxin. J Oral Sci Res, 2016, 32(9): 902–906 (in Chinese).吳家媛, 劉建國(guó), 馬欣榮, 等. 變異鏈球菌表面蛋白A區(qū)與霍亂毒素B亞單位嵌合基因轉(zhuǎn)基因黃瓜植株的獲得及鑒定. 口腔醫(yī)學(xué)研究, 2016, 32(9): 902–906.

[42] Yang H, Liu XJ, Liang GY, et al. Establishment of genetic transformation system byof cucumber. Southwest China J Agric Sci, 2014, 27(4): 1656–1660 (in Chinese).楊宏, 劉小俊, 梁根云, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的華南型黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步研究. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 27(4): 1656–1660.

[43] Zhang SJ, Wang XF, Yang XH, et al. Variation of endogenous phytohormone concentration in cotyledonary node calli during cucumber regeneration. Acta Agric Bor-Occid Sin, 2011, 20(5): 153–157 (in Chinese).張守杰, 王秀峰, 楊小華, 等. 黃瓜子葉節(jié)離體再生過(guò)程中內(nèi)源激素變化. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 20(5): 153–157.

[44] Cao LX, Zhao L, Tang YL, et al. Stimulation effect of silver nitrate on shoot regeneration in cotyledon tissue culture of cucumber. J Gansu Agric Univ, 2001, 36(2): 168–171 (in Chinese).曹利仙, 趙鸝, 唐宇力, 等. 硝酸銀對(duì)黃瓜離體子葉培養(yǎng)芽再生的促進(jìn)效應(yīng). 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 36(2): 168–171.

[45] Cheng ZM, Schnurr JA, Kapaun JA. Timentin as an alternative antibiotic for suppression ofin genetic transformation. Plant Cell Rep, 1998, 17(8): 646–649.

[46] Zhao FQ, Yin X, Hong WJ, et al. Tissue culture and rapid propagation of. Plant Physiol J, 2017, 53(9): 1666–1672 (in Chinese).趙富群, 尹茜, 洪文君, 等. 毛棉杜鵑的組織培養(yǎng)與快速繁殖. 植物生理學(xué)報(bào), 2017, 53(9): 1666–1672.

[47] He ZQ, Duan ZZ, Liang W, et al. Mannose selection system used for cucumber transformation. Plant Cell Rep, 2006, 25(9): 953–958.

[48] Hu BW, Li DW, Liu X, et al. Engineering non-transgenic gynoecious cucumber using an improved transformation protocol and optimized CRISPR/Cas9 system. Mol Plant, 2017, 10(12): 1575–1578.

[49] Wang G, Zhang X, Wang P, et al. The induction and tolerance to mannose of adventitious bud derived from cotyledonary nodes in cucumber. Crops, 2014, (6): 32–35 (in Chinese).王罡, 張栩, 王萍, 等. 黃瓜子葉節(jié)不定芽的誘導(dǎo)及對(duì)甘露糖耐性的研究. 作物雜志, 2014, (6): 32–35.

[50] Wei AM, Du SL, Han YK, et al. Study on transformation technology throughmediation in living cucumber plants. Mol Plant Breed, 2014, 12(4): 796–801 (in Chinese).魏愛(ài)民, 杜勝利, 韓毅科, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜活體植株轉(zhuǎn)基因方法研究. 分子植物育種, 2014, 12(4): 796–801.

[51] Anjum NA, Rodrigo MAM, Moulick A, et al. Transport phenomena of nanoparticles in plants and animals/humans. Environ Res, 2016, 151: 233–243.

Advances in-mediated transgenic cucumber

Li’ang Chai, Huaifu Fan, Chen Liu, and Changxia Du

Zhejiang Provincial Key Laboratory of Agricultural Product Quality Improvement Technology, College of Agriculture and Food Science, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China

Cucumber () is an important vegetable crop in the world.-mediated transgenic technology is an important way to study plant gene functions and improve varieties. In order to further accelerate the transgenic research and breeding process of cucumber, we described the progress and problems of-mediated transgenic cucumber, from the influencing factors of cucumber regeneration ability, genetic transformation conditions and various additives in the process. We prospected for improving the genetic transformation efficiency and safety selection markers of cucumber, and hoped to provide reference for the research of cucumber resistance breeding and quality improvement.

cucumber, transgenic, regenerative capacity, genetic transformation efficiency

June 20, 2019;

September 2, 2019

Supported by: Natural Science Foundation of Zhejiang Province, China (Nos. LY18C150004, LY18C150003, LY15C150006).

Changxia Du. Tel: +86-571-63741277; E-mail: changxiadu@zafu.edu.cn

10.13345/j.cjb.190265

浙江省自然科學(xué)基金(Nos. LY18C150004，LY18C150003，LY15C150006) 資助。

2019-10-10

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20191010.0927.001.html

柴里昂, 樊懷福, 劉晨, 等. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(4): 643–651.

Chai LA, Fan HF, Liu C, et al. Advances in-mediated transgenic cucumber. Chin J Biotech, 2020, 36(4): 643–651.

(本文責(zé)編 陳宏宇)