李鵬沖，張立攀*，關(guān)炳峰，趙夢(mèng)瑤，李娜，高火亮

河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司（鄭州 450002）

山茱萸（Cornus officinalisSieb. et Zucc）為落葉喬木或灌木，山茱萸科。其果實(shí)稱(chēng)萸肉，干燥成熟的果肉是我國(guó)著名的傳統(tǒng)中藥，于2016年被列入《中國(guó)藥典》和《可用于保健食品物質(zhì)名單》，具有治療和保健功能[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載山茱萸可補(bǔ)益肝腎、澀精固脫[2]；當(dāng)代醫(yī)學(xué)研究指出山茱萸具有調(diào)節(jié)免疫、抗艾滋、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂等功效[3]。

新食品原料山茱萸營(yíng)養(yǎng)成分十分豐富，含有糖類(lèi)、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等多種微量元素[4]。目前有相關(guān)工作人員對(duì)山茱萸抗氧化成分[5]、保健作用[6]、化學(xué)成分及藥理作用[7]、山茱萸果肉的分析[8]等進(jìn)行研究。另外目前對(duì)山茱萸中馬錢(qián)苷、莫諾苷、熊果酸等的測(cè)定主要集中在醇提液相方法，此次試驗(yàn)利用先醇提后水提殘?jiān)桨竵?lái)減少試驗(yàn)過(guò)程中的誤差。此次試驗(yàn)主要測(cè)定山茱萸的營(yíng)養(yǎng)成分以及有機(jī)酸具體含量，為今后山茱萸產(chǎn)品的研發(fā)及更針對(duì)性研究提供試驗(yàn)和科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設(shè)備

氨基酸分析儀，蘇州華美辰儀器設(shè)備有限公司；Soxtec 8000粗脂肪提取儀，F(xiàn)OSS有限公司；8400凱氏定氮儀，F(xiàn)OSS有限公司；1290高效液相色譜儀，美國(guó)；PF52原子熒光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SA520原子熒光形態(tài)分析儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SX-4-10箱式電阻爐，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；MS-105DU電子天平，上海臺(tái)隆電子衡器有限公司；QJ-08B 400克多功能粉碎機(jī)，上海兆申科技有限公司；SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；LGJ-12真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；KW-1000DC HH恒溫水浴鍋，金壇市中大儀器廠；101-1AB電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰思特儀器有限公司。

1.2 試劑

山茱萸，購(gòu)自霍山縣醉山石斛有限公司；鹽酸（HCl），濃度≥36%，優(yōu)級(jí)純；苯酚（C6H5OH）；氮?dú)猓∟2）；檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O）；氫氧化鈉（NaOH），優(yōu)級(jí)純；硫酸銅（CuSO4）；硫酸鉀（K2SO4）；硼酸（H3BO3）；冰乙酸（CH3COOH）；硝酸（HNO3）；碘（I2）碘化鉀（KI）；乙醚（C4H10O）；馬錢(qián)苷標(biāo)準(zhǔn)品、莫諾苷標(biāo)準(zhǔn)品、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品等均為分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 原材料處理

將已購(gòu)買(mǎi)山茱萸，人工除核、梗及其他雜質(zhì)，于60℃烘干，粉碎后過(guò)60目篩，于70℃干燥6 h，收集備用[9]。

2.2 營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

2.2.1 有機(jī)酸測(cè)定

1) 總有機(jī)酸提取：精確稱(chēng)取5.000 g山茱萸粉末至燒杯中，加入少量蒸餾水（除CO2），水浴提取0.5 h（水浴溫度設(shè)75℃），脫色、過(guò)濾、收集濾液并定容于100 mL容量瓶中，備用。

2) 總有機(jī)酸含量[10]：吸50 mL提取液于錐形瓶中，滴入2滴1%酚酞指示劑。用NaOH標(biāo)準(zhǔn)液（0.1 mol/L）滴至微紅并0.5 h不變色。按式（1）計(jì)算總有機(jī)酸含量。

式中：m為山茱萸粉質(zhì)量，g；K為換算主要酸系數(shù)，0.075；V為消耗NaOH體積，mL；C為NaOH濃度，mol/L。

2.2.2 總糖的測(cè)定

2.2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作[11]

準(zhǔn)確稱(chēng)取葡萄糖于105℃進(jìn)行干燥至恒質(zhì)量，用娃哈哈水制備質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖溶液。分別吸0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7和0.8 mL于試管中，用移液槍補(bǔ)足1 mL，加入1 mL 5%熏蒸酚，迅速搖勻；加入5 mL濃硫酸，迅速搖勻，靜置10 min；于沸水浴15 min，冷卻室溫，在490 nm處測(cè)吸光度。

2.2.2.2 供試液的制備

山茱萸多糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸法，略作修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取2.000 g山茱萸粉末，在沸水浴中3 h，攪拌。于3 000 r/min、10 min離心，收集上清液，定容50 mL容量瓶中。參考葡萄糖標(biāo)曲操作進(jìn)行試驗(yàn)，平行3次，并做空白對(duì)照。

2.2.3 黃酮類(lèi)化合物的測(cè)定

2.2.3.1 蘆丁標(biāo)曲的制作

參考向繼明等[12]、魏永生等[13]的方法，略作修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取定量蘆丁標(biāo)品，用60%乙醇配質(zhì)量濃度為0，2，4，6，8和10 μg/mL蘆丁標(biāo)品樣液，分別吸1 mL于10 mL容量瓶中，加0.5 mL 5% NaNO2溶液，靜置6 min，加0.5 mL 10% Al(NO3)3，混勻放置6 min，最后加4 mL 4% NaOH溶液，混勻放置12 min。采用分光光度計(jì)法在510 nm處測(cè)吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（y），蘆丁濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3.2 供試液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取4.000 g山茱萸粉末，用60%的乙醇溶解，超聲0.5 h，于回流提取溫度85℃提取2 h。以4 000 r/min離心10 min，取上清液并定容50 mL容量瓶。

2.2.4 馬錢(qián)苷、莫諾苷、熊果酸的測(cè)定

2.2.4.1 標(biāo)曲的制作

分別精密稱(chēng)取馬錢(qián)苷、莫諾苷、熊果酸標(biāo)品各10.0 mg溶于5 mL容量瓶中，配置梯度為20，50，100，200和500 μg/mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)膜于液相小瓶，試驗(yàn)備用

2.2.4.2 供試液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 g山茱萸粉末于容量瓶中，用25 mL甲醇溶解，靜置3 h，超聲20 min，超聲溫度35℃，功率40 kHz，抽濾定容50 mL；將濾紙上的殘?jiān)娓芍梁愣ǎ芊Q(chēng)取0.400 0 g山茱萸殘?jiān)?，操作同上，溶劑為蒸餾水；分別過(guò)0.22 μm有機(jī)膜、水膜，收集于液相小瓶，試驗(yàn)備用。

2.2.4.3 色譜條件

色譜柱：Lichrospher C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相A 0.1%磷酸環(huán)糊精水溶液，流動(dòng)相B乙腈。梯度洗脫：0～5 min，60% A；5～6 min，60%～30% A；6～11 min，30%～10% A；11～13 min，10% A；13～14 min，10%～90% A；14～16 min，90% A。流速1.0 mL/min，柱溫30℃，體積流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

2.2.5 其他營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

蛋白質(zhì)：參考GB 5009.5—2016。淀粉：參考GB 5009.9—2016。脂肪：參考GB 5009.6—2016。水分：參考GB 5009.3—2016。氨基酸：參考GB 5009.124—2016，GB/T 30987—2014。礦物質(zhì)元素：參考GB 5009.268—2016。維生素B2：參考GB 5009.85—2016。維生素B12：參考GB/T 5009.217—2008。維生素E：參考GB 5009.82—2016。維生素C：參考GB 5009.86—2016。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過(guò)圖1與圖2可以看出，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y= 0.018x-0.061 4，R2=0.999；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.289 2x- 0.005，R2=0.999 9。說(shuō)明兩種曲線的線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 山茱萸營(yíng)養(yǎng)成分分析

山茱萸基本營(yíng)養(yǎng)元素如表1所示。山茱萸干粉有機(jī)酸含量為10.14%，總糖含量為9.45%，黃酮類(lèi)化合物含量為0.93%，水分含量為6.85%。山茱萸原果水分含量為75.44%。維生素C含量為0.312 0 g/100 g，維生素E含量為0.046 9 g/100 g，維生素B2含量為0.088 4 g/100 g，維生素B12含量為0.049 3 g/100 g。

3.3 山茱萸礦物質(zhì)元素分析

山茱萸礦物質(zhì)元素如表2所示。山茱萸中微量元素十分豐富，從山茱萸干粉中測(cè)出21種礦物質(zhì)元素。其中K元素含量（23 552 mg/kg）最為豐富，其次為鎂、鈣、鐵，其他元素相對(duì)較少。另所含人體必需的7種微量元素（鋅、銅、鎘、鉛、鋇、鈦、銣）。其中在山茱萸粉中檢測(cè)出天然放射性U元素，其含量達(dá)到0.017 mg/kg。

表1 山茱萸干粉基本營(yíng)養(yǎng)元素表

表2 山茱萸礦物質(zhì)元素

3.4 山茱萸氨基酸的分析

山茱萸氨基酸分析如表3所示。山茱萸干粉與山茱萸原漿果分別含有16種氨基酸（天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸），其含量分別為22.14和4.48 g/kg；其中山茱萸干粉中天冬氨酸、谷氨酸含量較高，分別為4.26，3.02，0.86和0.68 g/kg；另外山茱萸干粉共含有12種游離氨基酸（天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸），含量為1.9 g/kg；山茱萸原果漿亦含有12種游離氨基酸（天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸），含量為0.48 g/kg。山茱萸干粉與山茱萸原漿果均含有人體必需6種氨基酸（賴(lài)氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸），含有嬰幼兒必需的7種氨基酸（賴(lài)氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸）。

表3 山茱萸氨基酸分析表 g/kg

3.5 馬錢(qián)苷、莫諾苷、熊果酸的分析

圖3 各成分HPLC色譜圖

經(jīng)色譜方法，對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行跑樣，其馬錢(qián)苷回歸方程y1=0.086 5x-4.226 3，R2=0.999 8；莫諾苷回歸方程y2=0.08x-4.164 5，R2=0.999 7；熊果酸回歸方程y3=0.132 4x-1.184 3，R2=0.999 6。表明標(biāo)準(zhǔn)品在配置濃度范圍內(nèi)與峰面積呈較好線性關(guān)系。

對(duì)照品、甲醇樣品、水提殘?jiān)鼧悠飞V圖如圖3所示。醇提山茱萸粉末中莫諾苷、馬錢(qián)苷、熊果酸含量分別為19.591 1，9.819 95和1.243 15 mg；水提殘?jiān)Z苷、馬錢(qián)苷、熊果酸含量分別為0.352 15，0.141 5和0 mg；得出山茱萸粉末中莫諾苷的總含量19.94 mg/g、馬錢(qián)苷總含量9.96 mg/g、熊果酸總含量1.24 mg/g，用溶劑蒸餾水再次提取醇提物后的殘?jiān)梢詼p少醇提方法的誤差，使得提取結(jié)果更加精確。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)山茱萸干粉營(yíng)養(yǎng)的試驗(yàn)可知山茱萸營(yíng)養(yǎng)豐富，并得出以下結(jié)論：

1) 山茱萸干粉中含有2.67%蛋白質(zhì)、5.79%淀粉、0.80%脂肪、6.85%水分、10.14%總酸、9.45%總糖、0.93%黃酮類(lèi)化合物、0.312 0 g/100 g維生素C、0.046 9 g/100 g維生素E、0.088 4 g/100 g維生素B2、0.049 3 g/100 g維生素B12。

2) 另測(cè)出山茱萸干粉中含有16種氨基酸，含量為22.14 g/kg；含人體必需氨基酸6種，含嬰幼兒必需氨基酸7種；另干粉中含有12種游離氨基酸，含量為1.9 g/kg。山茱萸果漿中含4.48 g/kg氨基酸，1.48 g/kg游離氨基酸。

3) 測(cè)出山茱萸干粉中21種礦物質(zhì)元素，其中K元素含量（23 552 mg/kg）最為豐富，其次為鎂、鈣、鐵，其他元素相對(duì)較少，所含人體必需的7種微量元素（鋅、銅、鎘、鉛、鋇、鈦、銣）。其中在山茱萸粉中檢測(cè)出天然放射性U元素，其含量達(dá)到0.017 mg/kg。

4) 通過(guò)先醇提后水提殘?jiān)姆椒y(cè)出山茱萸粉末中莫諾苷含量19.94 mg/g、馬錢(qián)苷含量9.96 mg/g、熊果酸含量1.24 mg/g。

此次試驗(yàn)為今后山茱萸產(chǎn)品的研發(fā)及更針對(duì)性研究提供試驗(yàn)和科學(xué)依據(jù)。