肖偉敏，王奇，董珊，蘇佳婷，彭祖茂，張協(xié)光?

深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，國(guó)家營(yíng)養(yǎng)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣東）（深圳 518109）

木酚素是一類有苯丙素氧化聚合而成的天然化合物，屬于植物雌激素，與人體雌激素十分相似，具有弱激素和抗雌激素雙向調(diào)節(jié)功能，以及非常高的抗氧化活性，在抗癌、保護(hù)心血管、治療糖尿病等方面有良好效果[1-6]。已報(bào)道的木酚素物質(zhì)主要有亞麻木酚素（SDG）、開(kāi)環(huán)異落葉松脂醇、落葉松脂醇、馬臺(tái)樹(shù)脂醇、芝麻素、芝麻林素、芝麻酚等，其中SDG、芝麻素、芝麻林素、芝麻酚的含量較高，亞麻籽中SDG的含量可達(dá)0.5%～1%；芝麻中芝麻素和芝麻林素的含量為0.5%～1%；谷物、蔬菜、水果等食品的木酚素含量較低[7]。含木酚素食品的日常攝入對(duì)人類慢性病有潛在的有益作用[8]，因此針對(duì)食品中有生物活性的木酚素類營(yíng)養(yǎng)成分，建立相關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法對(duì)于建立食品營(yíng)養(yǎng)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)、進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)膳食補(bǔ)充指導(dǎo)以及開(kāi)發(fā)木酚素營(yíng)養(yǎng)保健食品均具有重要意義。

隨著木酚素類物質(zhì)在營(yíng)養(yǎng)食品、保健食品等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，相關(guān)營(yíng)養(yǎng)保健食品在英國(guó)、美國(guó)等均已面市多年；一些復(fù)合營(yíng)養(yǎng)食品如枸杞山藥芝麻粉、植物益生元八珍粉等，均含有亞麻木酚素和芝麻木酚素類物質(zhì)，但目前國(guó)內(nèi)還缺乏該類產(chǎn)品的質(zhì)量技術(shù)支持。已報(bào)道的木酚素檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)[9-10]主要是紫外分光光度法[11]、高效液相色譜法（HPLC）分別檢測(cè)SDG和芝麻木酚素[12-13]，樣品適用于亞麻籽、芝麻及其制品。紫外分光光度法測(cè)定干擾大，定量不準(zhǔn)確；HPLC靈敏度達(dá)不到木酚素含量較低食品的定量水平；已報(bào)道的UPLC-MS/MS法未同時(shí)測(cè)定芝麻木酚素[14-15]。

鑒于尚未有同時(shí)檢測(cè)食品中主要木酚素物質(zhì)（SDG、芝麻素、芝麻林素、芝麻酚）的標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道，以及質(zhì)量監(jiān)管和質(zhì)量技術(shù)支持的需求，試驗(yàn)首次建立UPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)食品中亞麻木酚素、芝麻酚、芝麻素、芝麻林素的方法。該方法適用范圍廣，準(zhǔn)確簡(jiǎn)便，可為后期木酚素的科學(xué)研究提供有效的數(shù)據(jù)查詢，為居民營(yíng)養(yǎng)膳食提供科學(xué)指導(dǎo)，并能促進(jìn)相關(guān)基礎(chǔ)應(yīng)用和臨床應(yīng)用的研究發(fā)展，更為后期國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的建立和市場(chǎng)產(chǎn)品監(jiān)督提供足夠的技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000）；三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific TSQ Quautis）；分析天平（Sartorius，感量0.1 mg）。

亞麻木酚素、芝麻素、芝麻林素標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自安譜，純度≥98.8%）；芝麻酚標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自CATO，純度99.9%）；4種木酚素的化學(xué)信息見(jiàn)表1。氫氧化鈉和無(wú)水乙醇為分析純，甲醇和甲酸為色譜純；芝麻香油（自制）；其余樣品市售。

1.2 試劑配制

70%乙醇：量取70 mL無(wú)水乙醇加水稀釋至100 mL，混勻。

70%乙醇-1 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取20 g氫氧化鈉，用適量水溶解，冷卻后定容至150 mL，與350 mL無(wú)水乙醇于燒杯中混勻。

鹽酸溶液（10.6 mol/L）：量取88 mL鹽酸加水稀釋至100 mL，混勻。

表1 4種木酚素的化學(xué)信息

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用甲醇配制質(zhì)量濃度均為1.00 mg/mL的亞麻木酚素、芝麻酚、芝麻素、芝麻林素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃保存。然后稀釋配制4種木酚素質(zhì)量濃度為0.040 0，0.100，0.400，1.00，2.00和10.0 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 分析條件

1.4.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～3 min，70%～40% A；3～5 min，40%～20% A；5～9 min，20%～2% A；9～12.5 min，2% A；12.5～12.6 min，70% A；12.6～15 min，70% A。流速0.3 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣體積2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源正離子模式（ESI+）；選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）掃描；離子源電壓3 500 V；蒸發(fā)溫度360℃；離子傳輸管溫度300℃；鞘氣（N2）42 bar，輔助氣（N2）10 bar，吹掃氣0 bar。4種木酚素質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 4種木酚素的UPLC-MS/MS分析參數(shù)

1.5 樣品前處理

1.5.1 試樣制備

液體或固體粉末樣品：將樣品混合均勻后，立即測(cè)定或于冰箱中冷藏。

新鮮水果和蔬菜類：取500 g左右樣品，用勻漿機(jī)或者粉碎機(jī)將樣品均質(zhì)，制得均勻性一致的勻漿，立即測(cè)定或者于冰箱中冷凍保存。

其他含水量較低的固體樣品：如含水量在15%左右的谷物，取100 g左右樣品，用粉碎機(jī)將樣品粉碎，制得均勻性一致的粉末，立即測(cè)定或者于冰箱中冷藏保存。

1.5.2 試樣處理

稱取0.5～5 g混合均勻的固體試樣或0.3～0.5 g油樣于50 mL離心管中，加入40 mL 70%乙醇-1 mol/L NaOH水溶液，漩渦混勻；于65℃空氣控溫?fù)u床上，以350 r/min振搖1 h。用10.6 mol/L鹽酸將pH調(diào)至4.0～4.5，用70%乙醇水溶液定容至50 mL，搖勻，離心；取清液，用0.45 μm微膜過(guò)濾，上機(jī)。若樣品中分析物的含量不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，用70%乙醇水溶液稀釋后上機(jī)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用蠕動(dòng)泵進(jìn)樣的方式，將1 μg/mL單標(biāo)溶液以10 μL/min的流速連續(xù)注入ESI源中，在正離子模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，得到待測(cè)物的母離子峰。優(yōu)化離子源氣流、電壓、溫度等參數(shù)，使母離子峰的響應(yīng)強(qiáng)度優(yōu)且穩(wěn)定；對(duì)母離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，確定子離子，優(yōu)化碰撞能量和RF lens。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

SDG分子中含有兩個(gè)葡萄糖苷單元，在ESI+模式下，產(chǎn)生的離子峰m/z709.17為[M+Na]+，響應(yīng)弱；m/z327.04為[M+H-2Glu-2H2O]+，是SDG脫去2個(gè)葡萄糖殘基（葡萄糖殘基：162 Da）和2分子水的離子峰，響應(yīng)較好；因此，選用m/z327.04作為SDG的母離子。m/z138.12為芝麻酚的離子峰[M+H]+。芝麻素、芝麻林素在ESI+模式下，易脫去1分子的水，形成[M+HH2O]+離子峰，分別為m/z337.04和m/z353.05。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

試驗(yàn)使用了Hypersll Gold（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）3種色譜柱。Hypersll Gold色譜柱分離4種木酚素時(shí)，SDG及芝麻酚的峰形拖尾；使用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱時(shí)，各物質(zhì)保留時(shí)間不穩(wěn)定；而ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱在分離4種木酚素時(shí)有較好的色譜峰和穩(wěn)定的保留時(shí)間。故選擇使用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱。

2.2.2 流動(dòng)相條件的優(yōu)化

試驗(yàn)比較了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)，SDG響應(yīng)不穩(wěn)定；而采用甲醇-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)，4種木酚素的響應(yīng)均較穩(wěn)定，峰形也好（圖1和圖2），推測(cè)SDG在甲醇-0.1%甲酸水體系下離子化效果較好。故采用甲醇-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。

圖1 4種木酚素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖

圖2 植物益生元八珍粉中4種木酚素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖

2.3 提取條件的確定

SDG為水溶性的木酚素，在自然條件下以聚合物形式存在，只有在被堿水解后才能游離出SDG單體；有機(jī)堿甲氧基鈉和三乙胺、無(wú)機(jī)堿氫氧化鈉均可完成此水解過(guò)程。SDG在醇?jí)A溶液中可以實(shí)現(xiàn)堿解與提取同時(shí)進(jìn)行，更簡(jiǎn)便高效，提取效果更好[15-16]。芝麻素、芝麻林素、芝麻酚為脂溶性的木酚素，甲醇和乙醇亦是常用提取溶劑[17]。因此，為實(shí)現(xiàn)同時(shí)提取食品中的4種木酚素，并綜合考慮安全性和經(jīng)濟(jì)性，試驗(yàn)選用常用的氫氧化鈉進(jìn)行堿解，以及更經(jīng)濟(jì)安全的乙醇浸提。

試驗(yàn)分別考察了60%，70%和80%乙醇-NaOH（1 mol/L）溶液提取亞麻籽中SDG、白芝麻中的芝麻素、芝麻林素的情況（圖3）。結(jié)果表明，70%乙醇-NaOH（1 mol/L）水溶液在提取SDG、芝麻素、芝麻林素時(shí)有更好的提取率。

圖3 乙醇比例對(duì)提取率的影響（n=3）

由于樣品中SDG的提取和樣品中油脂的皂化均與堿濃度大小有關(guān)。因此，試驗(yàn)分別用70%乙醇配制0.1，0.5，1，2和3 mol/L NaOH的提取液，考察不同堿濃度對(duì)木酚素提取的影響。亞麻籽、白芝麻中木酚素提取情況見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，堿濃度對(duì)SDG的提取有較大影響，1 mol/L NaOH乙醇溶液提取率最高；堿濃度增大到3 mol/L，提取率無(wú)明顯變化；堿濃度對(duì)芝麻中油脂皂化有一定影響，堿濃度升到0.5 mol/L后，芝麻素、芝麻林素的提取率未有明顯變化。綜合考慮SDG的提取條件，確定70%乙醇-1 mol/L NaOH水溶液為最佳提取溶劑。醇?jí)A溶液提取后的粗提液，經(jīng)HCl調(diào)節(jié)pH至4～4.5，蛋白或肽類的雜質(zhì)會(huì)沉淀下來(lái)，起到凈化作用。

圖4 NaOH濃度對(duì)提取率的影響（n=3）

2.4 線性范圍、檢出限與定量限

將木酚素系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按優(yōu)化方法進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)（x），以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（y）做線性回歸方程；以信噪比（S/N）為3和10分別計(jì)算檢測(cè)限和定量限，結(jié)果見(jiàn)表3。4種木酚素的相關(guān)系數(shù)R在0.999 5～0.999 9之間，線性范圍在0.040 0～

10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，各物質(zhì)的線性相關(guān)性較好。

2.5 回收率及精密度試驗(yàn)

亞麻籽油中未檢出4種木酚素成分，故試驗(yàn)采用亞麻籽油為空白樣品進(jìn)行加標(biāo)，分別添加低、中、高3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)添加水平做6個(gè)平行樣品，測(cè)定的回收率及精密度見(jiàn)表4。結(jié)果表明，4種木酚素的回收率范圍均在95.0%～101%之間，RSD在1.0%～3.1%之間，回收率和精密度符合GB/T 27404—2008 F.1和F.3的要求[18]。

表3 木酚素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

表4 4種木酚素的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.6 實(shí)際樣品分析

試驗(yàn)分別檢測(cè)了亞麻籽、黑芝麻、白芝麻、芝麻油、枸杞山藥芝麻酚、草莓干、茶葉、植物益生元八珍粉、木酚素軟膠囊等多種類型的樣品，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，亞麻籽中SDG含量較高，亞麻籽1的含量可達(dá)8.78×103mg/kg；而6種亞麻籽油均無(wú)SDG檢出，這是由于SDG是水溶性的化合物，不溶于油脂中；草莓干、山藥干、茶及木酚素軟膠囊保健食品中均有一定的SDG檢出；芝麻及其制品中含有較高的芝麻素和芝麻林素；自制芝麻油1中芝麻素含量為7.88×103mg/kg，芝麻林素含量為3.83×103mg/kg，市售芝麻油2中芝麻素含量為2.61×103mg/kg，芝麻林素未檢出，2種芝麻油中芝麻木酚素含量差異較大；枸杞山藥芝麻粉、植物益生元八珍粉等復(fù)合營(yíng)養(yǎng)食品，4種木酚素成分均有一定量的檢出（見(jiàn)圖2）。購(gòu)自美國(guó)的木酚素軟膠囊中檢出的亞麻木酚素為110 mg/kg，比蔬果類的亞麻木酚素含量高，但比亞麻籽中的木酚素含量低約80倍。

表5 食品中木酚素的含量 mg/kg

3 結(jié)論

試驗(yàn)首次采用UPLC-MS/MS法同時(shí)分析食品中的4種主要木酚素物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了蔬果制品、保健食品、茶葉等15個(gè)樣品中SDG、芝麻酚、芝麻素、芝麻林素的定量分析。該方法為一步醇?jí)A提取，簡(jiǎn)便高效，靈敏度高，可準(zhǔn)確檢測(cè)木酚素含量較低的食品，豐富了食品營(yíng)養(yǎng)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)分析自制芝麻油1和市售芝麻油2中的芝麻素和芝麻林素，可發(fā)現(xiàn)芝麻油產(chǎn)品中芝麻素和芝麻林素的含量差異明顯，芝麻木酚素可作為芝麻油的特征指標(biāo)，為市場(chǎng)上芝麻油的摻偽摻假鑒別提供一定的技術(shù)支持。