李翠芬，呂建秋，孔美蘭

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院（廣州 510642）

作為對(duì)生命體特殊生理功能的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，活性肽對(duì)機(jī)體生命活動(dòng)具有重要的作用，由于其可被人體腸道直接吸收，比氨基酸更易進(jìn)入血液，成為20世紀(jì)90年代后期的開發(fā)熱點(diǎn)[1]。在生物活性肽和功能性食品的研究中，通常會(huì)將生物活性肽作為食品及保健品原料或添加原料，其用途廣、前景佳、市場(chǎng)潛力大?？寡趸钚噪膹膶儆谏锘钚噪腫2]。生物體內(nèi)的具有抗氧化活性的物質(zhì)許多都屬于蛋白質(zhì)類，蛋白質(zhì)優(yōu)良的乳化特性，使其能在油水界面起橋梁作用，在清除過(guò)量自由基和抑制膜脂質(zhì)過(guò)氧化方面具有重要的研究意義[3]。隨著生物學(xué)的迅猛發(fā)展，發(fā)現(xiàn)由于結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，介于蛋白質(zhì)和氨基酸間的肽類與氨基酸、大分子蛋白質(zhì)等其他生物分子相比，其食用安全性、活性、多樣性更加突出。其抗氧化性比蛋白質(zhì)和氨基酸更為顯著[4]。

抗氧化肽是熱門的研究方向，抗氧化肽對(duì)于抑制、延緩脂質(zhì)氧化，保護(hù)人體組織器官免受自由基侵害有特定作用[4]。食物蛋白通過(guò)水解作用得到的抗氧化肽具有天然性、高安全性、強(qiáng)抗氧化性和易吸收性等特點(diǎn)[4-5]。抗氧化肽的作用機(jī)理是直接作用在自由基，或者間接消耗掉容易生成自由基的物質(zhì)，防止發(fā)生氧化反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)生[5]。

中華綠螂是一種低脂肪高蛋白食品，是粵東地區(qū)盛產(chǎn)的水產(chǎn)品，可作為制取抗氧化肽的優(yōu)質(zhì)原料。由于中華綠螂加工技術(shù)水平和回收手段落后，造成大量水溶性蛋白流失，且對(duì)廢水處理帶來(lái)新的難題[6]。試驗(yàn)以中華綠螂作為原料，利用響應(yīng)面法和超濾法，對(duì)中華綠螂中抗氧化肽的木瓜蛋白酶水解提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以減少?gòu)U水處理的負(fù)擔(dān)，并將沒有開發(fā)利用的蛋白資源轉(zhuǎn)化，成為高附加值的健康物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 材料

中華綠螂（2016年7月購(gòu)于潮州市楓春市場(chǎng)，所用部位為去殼后的肉，經(jīng)熱風(fēng)干燥和粉粹過(guò)篩后密封冷凍保存）。

1.1.2 試劑

木瓜蛋白酶（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，分析純，美國(guó)Sigma公司）；95%乙醇（分析純，東莞市正源化工有限公司）；鹽酸（分析純，佛山市偉豐貿(mào)易有限公司）；氫氧化鈉（分析純，德州市富凱化工有限責(zé)任公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（BSA124S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；酸度計(jì)（PB-10，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（HWS-24，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；高速臺(tái)式離心機(jī)（H1650，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；可見分光光度計(jì)（WFJ7200，尤尼柯儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DV，昆山市超聲儀器有限公司）；切向流超濾系統(tǒng)（BIOQ-MV1000，匯和堂生物工程設(shè)備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

原料的預(yù)處理→中華綠螂懸浮液→調(diào)值→設(shè)計(jì)不同溫度、pH、加酶量和水解時(shí)間的試驗(yàn)進(jìn)行酶解→95℃，滅酶→離心→上清液為含抗氧化肽的可溶性蛋白水解液→測(cè)定自由基清除率

最優(yōu)工藝條件下→重復(fù)上述步驟制備含抗氧化肽的可溶性蛋白水解液→超濾純化→測(cè)定自由基清除率→確定最佳超濾膜孔徑

1.3.2 試驗(yàn)步驟

1.3.2.1 原料預(yù)處理

將中華綠螂浸泡吐沙、沖洗、熱燙、去殼取肉、65℃下烘干、高速粉碎、50目過(guò)篩，得到中華綠螂粉即為試驗(yàn)原料，真空包裝并冷凍儲(chǔ)藏備用。

1.3.2.2 制備含抗氧化肽的可溶性蛋白水解液

準(zhǔn)確稱取1.00 g干燥的中華綠螂粉，置于燒杯中，加入30 mL新鮮制備的蒸餾水，攪拌使其形成懸濁液，用1 mol/L的NaOH溶液或1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至酸度計(jì)顯示出所需值為止，待恒溫水浴鍋升至所需溫度，一邊攪拌一邊往燒杯加入一定量木瓜蛋白酶，用保鮮膜封住杯口避免水分的揮發(fā)，把燒杯放置進(jìn)去，到達(dá)所需時(shí)間即反應(yīng)完畢，將燒杯拿出并置于95℃水浴中滅酶10 min，滅酶結(jié)束后用流水沖淋杯壁使之冷卻至常溫，離心（4 000 r/min、15 min）取上清液，即得不同濃度水解液[7]。

1.3.2.3 酶解物DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH自由基常用來(lái)研究酚類抗氧化劑構(gòu)效關(guān)系，是一種合成的有機(jī)自由基。DPPH乙醇溶液呈紫色，在波長(zhǎng)517 nm處有一強(qiáng)吸收，但是自由基清除劑與其單電子配對(duì)而使其吸收減弱，其褪色程度與接受的電子數(shù)呈定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)法進(jìn)行定量分析。

稱取0.025 6 g DPPH試劑，用乙醇50%溶解，定容轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，將DPPH儲(chǔ)備液搖勻，質(zhì)量濃度為0.025 6 g/100 mL，置于冰箱冷凍備用，在使用之前將50%乙醇稀釋成質(zhì)量濃度0.002 5 g/100 mL。將DPPH溶液在正常室溫的情況下放置10 min后，在反應(yīng)容器中加入2 mL 0.002 5 g/100 mL的DPPH乙醇溶液，加入2 mL不同濃度的中華綠螂肉蛋白質(zhì)水解液，混合搖勻，在正常的室溫情況下避光反應(yīng)30 min，將50%乙醇?xì)w零，測(cè)定波長(zhǎng)517 nm處吸光度（A0）。測(cè)定2 mL DPPH溶液與2 mL 50%乙醇溶液在波長(zhǎng)517 nm處吸光度（Ai），測(cè)定2 mL樣品待測(cè)液與2 mL 50%乙醇溶液在波長(zhǎng)517 nm處吸光度（Aj）。在同一條件下重復(fù)3次，計(jì)算求出自由基清除率，取平均值[8]。

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化中華綠螂抗氧化肽提取工藝

2.1.1 單因素試驗(yàn)指標(biāo)

分別在固定的酶與底物濃度比值（[E]/[S]）、酶解溫度、酶解pH和酶解時(shí)間條件下，考察酶與底物濃度的比值（[E]/[S]）、酶解溫度、酶解pH和酶解時(shí)間對(duì)中華綠螂含抗氧化肽的可溶性蛋白的自由基清除率的影響。

根據(jù)單因素條件試驗(yàn)，初步選定酶與底物濃度比值（[E]/[S]）5%、酶解溫度55℃、酶解pH 5.0和酶解時(shí)間2.5 h為最佳提取條件，采用響應(yīng)面法對(duì)酶解提取中華綠螂中抗氧化肽的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化[9]。

2.1.2 響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）、酶與底物濃度的比值（C）和酶解pH（D）作為影響因素[9]，以DPPH自由基清除率（R）作為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Beknhen中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)進(jìn)行29次，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)做3次，結(jié)果取3次數(shù)據(jù)的平均值。采用隨機(jī)化原則以減少隨機(jī)誤差。試驗(yàn)安排及結(jié)果見表1和表2。

表1 中華綠螂抗氧化肽提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

表2 中華綠螂抗氧化肽提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.1.3 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

試驗(yàn)用酶解法處理中華綠螂以提取抗氧化肽，以自由基清除率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化最佳工藝條件，利用Design-Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式模型和多元線性模型擬合，得到最佳的數(shù)學(xué)模型。

從方差分析及相關(guān)系數(shù)考察模型可靠性。由表3可知，模型F=2.57＞F0.05(14,14)=2.48，p＜0.05，證明試驗(yàn)所用二次多項(xiàng)模型具有顯著性。在總的作用因素下，B項(xiàng)的影響顯著，而方程的交互項(xiàng)p＞0.05，表明其對(duì)中華綠螂抗氧化肽提取的影響不顯著，各具體因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，各因子間交互作用影響不顯著，可忽略。失擬項(xiàng)F=1.86，在α=0.05水平上不顯著，說(shuō)明該模型能很好地描述試驗(yàn)結(jié)果，可用該模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)中華綠螂提取抗氧化肽的工藝結(jié)果[9]。

2.1.4 提取工藝的響應(yīng)曲面分析與純化

為更直觀地表現(xiàn)2個(gè)因素對(duì)中華綠螂抗氧化肽含量的影響，可以令其他因素水平值為零，即是以酶與底物濃度的比值（[E]/[S]）、酶解溫度、酶解pH和酶解時(shí)間4個(gè)因素中1個(gè)因素取零水平時(shí)，另3個(gè)因素對(duì)中華綠螂抗氧化肽自由基清除率得影響進(jìn)行分析。圖1～圖6反映各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。

結(jié)果顯示，B（酶解溫度）對(duì)中華綠螂提取抗氧化肽的效果影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，隨著A（酶解時(shí)間）、C（酶與底物濃度比值）、D（酶解pH）增加或減小，響應(yīng)值變化較大；A（酶解時(shí)間）、C（酶與底物濃度比值）、D（酶解pH）對(duì)響應(yīng)值影響較小，曲線較為平滑，其數(shù)值的增加或者減小，對(duì)響應(yīng)值變化都較小[9]。

表3 回歸方程各項(xiàng)的方差分析表

圖1 酶解時(shí)間與酶解溫度的響應(yīng)曲面關(guān)系圖

圖2 酶解時(shí)間與酶用量的響應(yīng)曲面關(guān)系圖

圖3 酶解時(shí)間與pH的響應(yīng)關(guān)系圖

圖4 酶解溫度與酶用量的響應(yīng)關(guān)系圖

圖5 酶解溫度與pH的響應(yīng)關(guān)系圖

考慮到實(shí)際操作的可行性，將提取抗氧化肽工藝條件修正為酶解時(shí)間3 h、酶解溫度46.9℃、酶與底物濃度比值6%、酶解pH 4.11，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，中華綠螂抗氧化肽自由基清除率為97.93%，與理論值基本吻合，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定實(shí)用價(jià)值。

表4 中華綠螂抗氧化肽自由基清除率最優(yōu)值及其最大得率的預(yù)測(cè)值表

2.2 超濾法純化對(duì)其抗氧化性的影響

固定操作壓力、操作溫度及料液質(zhì)量濃度等工藝參數(shù)來(lái)考察5個(gè)不同截留相對(duì)質(zhì)量的超濾膜對(duì)可溶性蛋白酶解物的初步分離純化效果[10]。

由表5可見，截留相對(duì)質(zhì)量3 000～1 000 Da的超濾膜對(duì)于中華綠螂抗氧化肽自由基清除率的效果最好，為94.96%，說(shuō)明抗氧化肽的相對(duì)分子量在3 000～1 000 Da，有利于抗氧化肽與大分子物質(zhì)、溶劑的分離，有分離時(shí)間短，不發(fā)生相變，以及成本低等優(yōu)點(diǎn)，且易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

表5 不同截留相對(duì)質(zhì)量的超濾膜對(duì)中華綠螂抗氧化肽自由基清除率影響表

3 結(jié)論

圖6 酶用量和pH的響應(yīng)關(guān)系圖

2.1.5 提取工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證

用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，可以得到最優(yōu)條件：A（酶解時(shí)間）3.09 h（實(shí)際應(yīng)用采用3 h）、B（酶解溫度）46.9℃、C（酶與底物濃度比值）6%、D（酶解pH）4.11。此時(shí)中華綠螂抗氧化肽自由基清除率可達(dá)98.89%，可得到方程R1= 84.47-0.32A-9.68B+7.92AB-11.5B2。

木瓜蛋白酶水解中華綠螂制備抗氧化肽的最優(yōu)工藝條件為：底物濃度6%、pH 4.11、酶解溫度40℃、酶解時(shí)間3.09 h、超濾膜截留分子質(zhì)量3 000～1 000 Da。在此條件下，中華綠螂抗氧化肽對(duì)DPPH自由基清除率為97.64%，超濾所得可溶性蛋白酶解物的抗氧化性為94.96%，所得回歸模型顯著（p＜0.05），與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。由此看來(lái)，中華綠螂蛋白酶解物中存在清除自由基的活性肽，表現(xiàn)出較好抗氧化能力，為中華綠螂制取天然抗氧化肽提供理論依據(jù)。

4 展望

隨著生活水平的提高，人們逐漸認(rèn)識(shí)到人的衰老和許多疾病與體內(nèi)物質(zhì)氧化產(chǎn)生的自由基密切相關(guān)[10]。在人體新陳代謝過(guò)程中會(huì)不斷產(chǎn)生各種自由基，并作為難以分解的代謝物殘留在人體內(nèi)。自由基是指含有一個(gè)或多個(gè)未配對(duì)電子的分子、原子、基團(tuán)或離子，化學(xué)性質(zhì)活潑，反應(yīng)性極強(qiáng)，容易反應(yīng)生成穩(wěn)定分子[11]。

因此，把抗氧化肽作為抗氧化劑應(yīng)用到食品、化妝品和醫(yī)療保健品等行業(yè)中，抗氧化肽可以做到營(yíng)養(yǎng)、天然、安全、無(wú)毒、健康、保健的要求。

抗氧化劑被廣泛應(yīng)用于化妝品、食物，生產(chǎn)量最大的是化學(xué)抗氧化劑，但受到毒性作用的限制。由于水解反應(yīng)制備的抗氧化肽毒性小，更天然，更安全，因此往往比化學(xué)合成抗氧化肽更受到青睞[12]?？寡趸允墙陙?lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)多肽生物活性研究中的一個(gè)熱點(diǎn)，來(lái)源于食物蛋白的抗氧化肽，不但抗氧化性優(yōu)良且安全性高，因而在保健食品及生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分可觀[12]。

中華綠螂可溶性蛋白回收利用制備抗氧化肽可對(duì)廢水處理發(fā)揮作用，減少資源浪費(fèi)，也為抗氧化的制備在水產(chǎn)領(lǐng)域開拓思路。