李成華，薛長(zhǎng)松，于斌

通化師范學(xué)院吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-長(zhǎng)白山植物種質(zhì)資源保護(hù)與利用實(shí)驗(yàn)室（通化 134001）

酸漿（Physali alkekengiL.）別名紅姑娘、燈籠草、菇蔫兒、姑娘兒、掛金燈，原產(chǎn)于中國(guó)，主要分布在吉林、遼寧、黑龍江、內(nèi)蒙古、四川、西藏等地，植株全身均可入藥[1]，其性味甘、酸，性寒，有清涼、消腫、利尿、清除自由基、抗腫瘤等功效。初步研究發(fā)現(xiàn)，酸漿入藥部位主要含黃酮、多酚類物質(zhì)[2]。植物中存在的酚類化合物可分為游離酚和結(jié)合酚。酚類化合物的分離提取的難易程度與其存在形態(tài)有關(guān)，游離酚易溶于水或有機(jī)溶劑，可直接萃取出來(lái)，結(jié)合酚需要水解破壞化學(xué)鍵后或水解、蒸煮等方式破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)才可提取[3-4]。結(jié)合酚廣泛分布在植物中，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[5]，體內(nèi)研究表明，在代謝途徑和生物活性方面與游離酚相比有所不同[6]。結(jié)合酚經(jīng)過(guò)胃和小腸消化，經(jīng)腸道微生物菌群發(fā)酵作用后，相對(duì)于游離酚，在結(jié)腸中釋放并產(chǎn)生更強(qiáng)生物活性[7-8]。開(kāi)展植物結(jié)合酚提取方法及評(píng)價(jià)其生物活性十分必要。Pérez-Jiménez等[9]研究表明，在水果中結(jié)合酚占比60%～90%，Wang等[10]研究表明棗籽中結(jié)合酚含量是游離酚的3倍多，結(jié)合酚的水解方法主要為堿水解和酸水解，堿水解主要破壞酯鍵，酸水解主要破壞糖苷鍵[11]，蘇東曉[12]、Arranze等[13]發(fā)現(xiàn)酸法水解得到的荔枝、小麥結(jié)合酚的含量及抗氧化能力均比減法高。

酸漿果結(jié)合酚提取工藝參數(shù)缺乏，以酸漿果為原料，采用酸水解法將結(jié)合酚從原料組織中釋放，采用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了結(jié)合酚的酸水解法提取工藝。在此基礎(chǔ)上，對(duì)酸漿果中的游離酚和結(jié)合酚進(jìn)行體外抗氧化研究。研究有利于開(kāi)展酸漿果中結(jié)合酚的提取及明確其含量，對(duì)評(píng)估酸漿果結(jié)合酚的總量及生物活性研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

酸漿果（2017年10月采自吉林省通化市周邊山上，干燥、粉碎備用）。

3-乙基苯并噻唑-6-磺酸（ABTS）、2, 4, 6-三吡啶基三嗪（TPTZ）（上海伊卡生物技術(shù)有限公司）；VC、2, 6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）、沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)161171-160921）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙醇、乙酸乙酯、甲醇等（均為分析純，天津市百世化工有限公司）。

酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）；HZQ-X100恒溫震蕩培養(yǎng)箱（大倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；HH-8型恒溫水浴鍋（常州冠軍儀器制造有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮）；PB-10型pH計(jì)（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 游離酚提取

參照徐菲等[14]方法進(jìn)行，取1 g酸漿果實(shí)粉末，加25 mL 60%的乙醇，50℃水浴鍋中加熱2 h，離心（4 000 r/min，20 min），過(guò)濾，保留上清液，殘?jiān)猛瑯臃椒ㄌ崛?次，合并上清液，定容至5 mL，得酸漿果游離酚。

1.2.2 結(jié)合酚提取

參照鞠亞辛等[15]方法，取充分提取游離酚后的果殘?jiān)糜趫A底燒瓶中，加入H2SO4溶液水解，離心（4 000 r/min，20 min），棄去殘?jiān)Ａ羯锨逡?，用NaOH將pH調(diào)至中性，加入20 mL乙酸乙酯萃取，萃取2次，合并萃取相，離心（4 000 r/min，20 min）。在45℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘余物用50%甲醇超聲定容至5 mL，得到果結(jié)合酚提取液，-20℃避光保存。

1.2.3 多酚含量測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取10.00 mg沒(méi)食子酸用蒸餾水定容至10 mL，得到Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)液，取2.5 mL Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水定容至25 mL得到Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)液0，1，2，3，4和5 mL，Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)液0.75，1.00和1.50 mL，用蒸餾水定容至5 mL，得到質(zhì)量濃度梯度為0，20，40，60，80，100，150，200和300 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

分別取上述標(biāo)準(zhǔn)使用液125 μL于試管中，加500 μL蒸餾水和125 μL福林酚，搖勻，反應(yīng)6 min，加1.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)7% Na2CO3溶液，加入1 mL蒸餾水，20℃下避光放置1.5 h后，在波長(zhǎng)760 nm下測(cè)定吸光度，重復(fù)3次。根據(jù)沒(méi)食子酸溶液質(zhì)量濃度和吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸方程為Y=4.936X-0.022 1（R2=0.999 0）。

1.2.3.2 樣品多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

根據(jù)1.2.3.1方法測(cè)定樣品結(jié)合酚含量，多酚含量以每g質(zhì)量中含沒(méi)食子酸當(dāng)量表示，計(jì)算如式（1）。

式中：C為測(cè)定的多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液總體積，μL；W為稱取樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化酸漿果結(jié)合酚提取條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇H2SO4濃度（A）、液料比（B）、水解時(shí)間（C）、水解溫度（D），利用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化酸漿宿萼結(jié)合酚提取條件。以結(jié)合酚提取量為響應(yīng)值（Y）進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平見(jiàn)表1。

水平編碼因素A H2SO4溶液濃度/%D水解溫度/℃+1 5 40∶1 10 40 0 10 50∶1 15 50-1 15 60∶1 20 60 B液料比/(mL·g-1) C水解時(shí)間/h

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 FRAP法抗氧化活性[16-17]

FRAP溶液的制備：分別配制10 mmol/L TPTZ溶液（40 mmol/L HCl溶液為溶劑），0.3 mol/L醋酸鈉緩沖液，20 mmol/L FeCl3溶液，三者體積1∶10∶1混合。

FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：配制10 mmol/L FeSO4溶解，準(zhǔn)確吸取該溶液適量，稀釋成濃度0.1，0.062 5，0.125，0.25，0.50，1和2 mmol/L溶液。準(zhǔn)確吸取各溶液10 mL，加FRAP溶液1 mL，純水1 mL，避光反應(yīng)30 min，595 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，11 mL純水加FRAP溶液1 mL為參比。以吸光度Y對(duì)濃度X作圖，擬合得到回歸方程Y=1.300 3X+0.021 3，r=0.999 8。

FRAP法抗氧化活性測(cè)定：精密吸取各酸漿宿萼游離酚、結(jié)合酚樣品溶液20 μL加180 μL FRAP溶液，于595 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度A樣品，精密吸取各酸漿宿萼游離酚、結(jié)合酚樣品溶液20 μL加180 μL純水，于595 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度A對(duì)照，F(xiàn)RAP以FeSO4mol·g-1表示。并用0.2 g/mL的VC、BHT溶液作對(duì)照。

1.2.5.2 ABTS+·清除能力測(cè)定[18-19]

ABTS+·溶液的制備：分別配制7.4 mmol/L ABTS+·溶液，2.6 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液，二者體積1∶1混合于棕色瓶中，避光反應(yīng)16 h，產(chǎn)生ABTS+·，將ABTS+·用甲醇稀釋，使其在734 nm波長(zhǎng)處吸光度為0.70±0.02。

ABTS+·的清除：精密吸取的各樣品溶液10 μL，分別加ABTS+·溶液190 μL，避光反應(yīng)20 min，于734 nm處測(cè)定吸光度A樣品，甲醇為空白對(duì)照，甲醇加工作液為樣品本底對(duì)照A對(duì)照，所測(cè)的值減掉空白對(duì)照算清除率。用0.2 g/mL的VC、BHT溶液作對(duì)照。計(jì)算各樣品溶液清除ABTS+·的IC50值。

ABTS+·清除率=（A對(duì)照-A樣品）/A對(duì)照×100%（2）

1.2.5.3 ·OH清除能力測(cè)定[20]

工作液配制：分別配制3 mmol/L FeSO4溶液，3 mmol/L H2O2溶液，3 mmol/L水楊酸溶液。

羥自由基的清除：樣品，50 μL FeSO4溶液加50 μL各樣品溶液加50 μL H2O2溶液，混勻，靜置10 min，加50 μL水楊酸溶液，混勻，靜置30 min，于492 nm處測(cè)吸光度A樣品；對(duì)照，50 μL FeSO4溶液加50 μL各樣品溶液加50 μL H2O2溶液，混勻，靜置10 min，加50 μL蒸餾水，混勻，靜置30 min，于492 nm處測(cè)吸光度A對(duì)照；空白，50 μL FeSO4溶液加50 μL蒸餾水加50 μL H2O2溶液，混勻，靜置10 min，加50 μL水楊酸，混勻，靜置30 min，于492 nm處測(cè)吸光度A空白。用0.2 g/mL的VC、BHT溶液作對(duì)照。計(jì)算各樣品溶液清除自由基的IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸漿果結(jié)合酚提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 H2SO4濃度對(duì)結(jié)合酚提取量的影響

固定液料比40∶1 mL/g，溫度50℃，水解時(shí)間15 h，改變H2SO4溶液濃度（5%，10%，15%，20%和25%），由圖1知，H2SO4濃度為10%時(shí)，結(jié)合酚提取量最大。適當(dāng)濃度酸能破壞糖苷鍵，釋放結(jié)合酚。隨著酸濃度增大，結(jié)合酚遭到破壞，結(jié)合酚提取量降低。故選H2SO4濃度為10%。

2.1.2 水解時(shí)間對(duì)結(jié)合酚提取量的影響

固定液料比40∶1 mL/g，溫度50℃，H2SO4濃度10%，改變水解時(shí)間（5，10，15，20和25 h），由圖2知，水解時(shí)間15 h時(shí)，結(jié)合酚提取量最大。故選水解時(shí)間為15 h。

圖1 H2SO4濃度對(duì)結(jié)合酚提取量的影響

圖2 水解時(shí)間對(duì)結(jié)合酚提取量的影響

2.1.3 液料比對(duì)結(jié)合酚提取量的影響

固定水解時(shí)間15 h、水解溫度50℃、H2SO4濃度10%，改變液料比（20∶1，30∶1，40∶1，50∶1和60∶1 mL/g），由圖3知，液料比為50∶1 mL/g時(shí)，結(jié)合酚提取量最大。故選液料比50∶1 mL/g。

圖3 液料比對(duì)結(jié)合酚提取量的影響

2.1.4 水解溫度對(duì)結(jié)合酚提取量的影響

固定水解時(shí)間15 h，液料比50∶1 mL/g，H2SO4濃度10%，改變水解溫度（30，40，50，60和70℃），由圖4知，水解溫度為50℃時(shí)，結(jié)合酚提取量最大。溫度升高有利于結(jié)合酚水解，溫度過(guò)高能導(dǎo)致結(jié)合酚發(fā)生分解，故選水解溫度為50℃。

2.2 酸漿果結(jié)合酚提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

采用響應(yīng)面分析法分析試驗(yàn)結(jié)果，以結(jié)合酚提取量為響應(yīng)值，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得回歸方程：Y=6.26-0.12A+0.018B+0.092C-0.48D+0.020AB-1.18AC+0.42AD-0.055BC-0.68BD-0.48CD-0.14A2-0.90B2-0.41C2+0.31D2。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。

圖4 水解溫度對(duì)結(jié)合酚提取量的影響

表2 擬合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果

由表3可知，以結(jié)合酚提取量為響應(yīng)值，回歸方程顯著性檢測(cè)p=0.048 5＜0.050，表明該二次方程模型顯著，回歸方程模型與實(shí)際擬合性較好，試驗(yàn)誤差小，證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化酸漿果結(jié)合酚提取工藝是可行的，各因素對(duì)結(jié)合酚提取量的影響依次為：水解溫度＞硫酸濃度＞液料比＞提取時(shí)間。

表3 響應(yīng)面法對(duì)酸漿果結(jié)合酚提取量的方差分析表

將表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面曲面分析，選擇2個(gè)交互的因素對(duì)結(jié)合酚提取量的影響進(jìn)行分析。根據(jù)回歸方程，考察擬合響應(yīng)面的形狀，分析水解時(shí)間、料液比、H2SO4溶液濃度、提取溫度對(duì)結(jié)合酚提取量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 各兩因素交互作用對(duì)結(jié)合酚提取影響的響應(yīng)圖

利用回歸方程分析結(jié)果繪制結(jié)合酚提取量隨各因素變化的響應(yīng)曲面圖，由響應(yīng)曲面圖知液料比、H2SO4濃度、提取溫度、水解時(shí)間對(duì)結(jié)合酚提取量的影響。由圖5可見(jiàn)，提取條件在一定范圍內(nèi)，與其他提取因素比較，液料比與水解時(shí)間交互因素與結(jié)合酚提取量呈明顯的拋物線關(guān)系；隨著液料比增加，結(jié)合酚提取量逐漸緩慢減少；隨著H2SO4濃度增加，結(jié)合酚提取量產(chǎn)量逐漸減少。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

由Design-Expert 8.0.6軟件分析，得出酸漿果結(jié)合酚提取的最優(yōu)條件。結(jié)果顯示，酸漿果結(jié)合酚提取的最佳條件是：液料比55∶1 mL/g、H2SO4濃度5%、水解時(shí)間16 h、提取溫度45℃。此時(shí)結(jié)合酚的提取量為8.81 mg/g。在此優(yōu)化條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，其結(jié)果顯示，酸漿果結(jié)合酚提取量為8.83±0.18 mg/g，與模型預(yù)期值的誤差為4.96%，說(shuō)明方程與試驗(yàn)情況擬合較好。

2.4 酸漿宿萼游離酚、結(jié)合酚抗氧化活性結(jié)果

2.4.1 Fe3+的還原活性

所有提取液對(duì)Fe3+-TPTZ復(fù)合物均表現(xiàn)出一定還原能力，見(jiàn)表4。酸漿果結(jié)合酚還原鐵能力與BHT相當(dāng)，比VC強(qiáng)；酸漿果游離酚原鐵能力介于BHT與VC間；F=283.173，p=0.000。

2.4.2 ABTS+·的清除能力

ABTS+·溶液呈藍(lán)綠色，遇到有供氫能力的抗氧化劑時(shí)，ABTS+·的產(chǎn)生被抑制，溶液變無(wú)色ABTS[21]。酸漿果游離酚、結(jié)合酚都有一定的ABTS+·清除能力，見(jiàn)表4，均比VC、BHT清除能力弱，F(xiàn)=6.331，p=0.017。

2.4.3 ·OH的清除能力

酸漿果游離酚、結(jié)合酚對(duì)·OH基團(tuán)表現(xiàn)出一定的還原能力，見(jiàn)表4，都比VC、BHT清除能力弱，F(xiàn)= 601.492，p=0.000。

及·OH法測(cè)定抗氧化活性的影響（n=4）

表4 游離酚、結(jié)合放你對(duì)FRAP法、ABTS+·法

3 結(jié)論與討論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化酸水解法提取酸漿果結(jié)合酚的工藝，最佳提取工藝條件為：液料比55∶1 mL/g、H2SO4濃度5%、水解時(shí)間16 h、提取溫度45℃。此時(shí)結(jié)合酚提取量為8.81 mg/g，在此條件下，酸漿結(jié)合酚提取量為8.83±0.18 mg/g，與模型預(yù)期值的誤差為4.96%，影響酸漿果結(jié)合酚得率大小的因素主次順序?yàn)椋核鉁囟龋玖蛩釢舛龋疽毫媳龋咎崛r(shí)間。其中，液料比與水解時(shí)間交互因素與結(jié)合酚提取量之間的交互作用顯著。

抗氧化結(jié)果顯示，酸漿果結(jié)合酚還原鐵能力與BHT相當(dāng)，比VC強(qiáng)；酸漿果游離酚原鐵能力介于BHT與VC間。酸漿果游離酚、結(jié)合酚都有一定的ABTS+·清除能力，均比VC、BHT清除能力弱，但比洋蔥醇提物[22]、朝鮮薊葉多酚[23]強(qiáng)。酸漿果游離酚、結(jié)合酚對(duì)·OH基團(tuán)的還原能力，都比VC、BHT清除能力弱，但比純化后綿馬貫眾多酚[24]和麥冬花多酚[25]強(qiáng)。

酚類化合物具有抗氧化活性，與其含量顯著相關(guān)[26]。結(jié)合酚廣泛存在于植物基質(zhì)中，與游離酚相似，如櫻桃[27]、茭白[28]等的結(jié)合酚均有很好的抗氧化活性。富含酚類化合物的食品進(jìn)入消化道，游離酚可在小腸內(nèi)酯酶的作用下水解，隨后被吸收利用；與細(xì)胞壁緊密結(jié)合的酚類化合物在小腸水解的少，在結(jié)腸微生物產(chǎn)生的水解酶作用下緩慢持續(xù)釋放，可能會(huì)使其在體內(nèi)發(fā)揮更長(zhǎng)的抗氧化作用[29]。游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚類化合物廣泛分布在植物中，不同存在形態(tài)的酚類化合物具有相似生物活性，不同生理活性。不同酚類化合物在體內(nèi)吸收代謝途徑和抗氧化方式不同，結(jié)合酚在體內(nèi)較為持續(xù)的抗氧化作用及潛在的生理活性值得進(jìn)一步探究。試驗(yàn)分別釆用DPPH法、ABTS+法及FRAP法研究酸漿宿萼結(jié)合酚抗氧化能力，3種方法側(cè)重點(diǎn)不同，能全面衡量被測(cè)物質(zhì)的抗氧化活性[30-31]，不同抗氧化模型，測(cè)得的抗氧化能力存在差異，可能是因?yàn)槟Ｐ筒煌?，抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)不同，抗氧化原理不同[32]。研究結(jié)果為酸漿果作為保健食品的深入開(kāi)發(fā)及酸漿宿萼結(jié)合酚開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)，避免資源浪費(fèi)。