陳漫漫，高鵬飛

(復旦大學附屬金山醫(yī)院，上海 201500)

在醫(yī)學動物實驗研究中，小鼠屬于最常用的實驗動物之一，常需在非麻醉狀態(tài)下對小鼠進行保定從而進行采血、注射等操作[1]。由于小鼠掙扎啃咬會對實驗人員安全造成威脅，徒手操作不便，必須借助固定裝置和輔助手段加以固定，從而保護實驗人員安全，縮短實驗時間，提高實驗效率[2]。目前，運用最多的是使用金屬或有機玻璃制成的固定器，利用小鼠本能進洞的思維[3]，使得小鼠主動進入固定器中(圖1A)。這些商品化的固定器價格較貴，如果對大批量實驗鼠使用固定器，必耗費較多金錢，并且讓實驗鼠主動進入固定器的過程困難，效率低下。另有其他文獻報道的自制新型小鼠固定裝置，但是制作過程較為復雜[4]。有研究人員使用礦泉水瓶制作簡易小鼠固定裝置，但是瓶體質地較軟，實驗鼠容易掙脫[5]。亦有些裝置體積較大不易存放且不易清洗[6]。鑒于上述小鼠固定器的不足，本文提出一種實驗鼠固定器的簡易制作方法，實驗人員自制方便，大批量應用而不需花費過多錢財，有助于節(jié)約實驗成本，提高動物實驗效率。

作者課題組從事應激的中醫(yī)藥治療研究。產后應激不但威脅產婦的身心健康并且影響嬰兒的生命安全。有關研究報道[7]孕期及產后應激會造成子代的下丘腦-垂體-腎上腺軸調節(jié)作用紊亂，導致子代出現(xiàn)異常的精神行為。為對產后母鼠應激疾病進行研究，自制簡易的小鼠束縛裝置，采用束縛應激方式，制造小鼠產后束縛應激模型。該模型在本課題組兩項國家自然科學基金面上項目里多次運用，實驗證明模型具有穩(wěn)定性和可重復性，可用于產后應激疾病的相關研究?，F(xiàn)對模型以及造模束縛裝置進行介紹。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

從上海西普爾-必凱實驗動物【SCXK(滬) 2013-0016】有限公司購入60只SPF級ICR小鼠，雌雄各半。6周齡雌鼠，雌性體重(23.1 ± 1.7)g；7周齡雄鼠，雄性體重(27.2 ± 1.8)g，全部小鼠安置在上海公共衛(wèi)生臨床中心的動物實驗室【SYXK(滬) 2015-0008】。動物房溫度(21 ± 1)℃，房內照明從早上7點到晚上7點，自由飲水與攝食。本研究所有的動物實驗根據美國國立健康衛(wèi)生指導且經復旦大學公共衛(wèi)生臨床中心動物護理與使用委員會認可。

1.2 方法

1.2.1 束縛裝置的制作

實驗室就地取材，取實驗室常規(guī)配備耗材50 mL離心管，自制簡易小鼠束縛裝置。該裝置不僅可以用于束縛應激模型的制備，而且可以用于尾靜脈采血、注射，實驗室內取材方便，制作簡便，操作亦是簡單且使用效果良好，可實現(xiàn)較長時間的保定。該裝置不僅能用于小鼠保定同樣也適用于大鼠。為了說明方便，以小鼠舉例。下文將逐步對該小鼠束縛裝置的制作、使用方法及注意事項進行介紹：

(1)束縛裝置的制備

選擇容量規(guī)格適合小鼠身型的離心管、剪刀、膠布、橡皮筋共四樣(圖1B)。例如50 mL離心管可用于產后束縛應激小鼠模型(體重在30 ～ 40 g之間)的制備[8](圖1C)。選擇合適規(guī)格的離心管，取掉離心管的蓋子，在離心管蓋上用剪刀扎透氣孔(圖1D)，然后用剪刀在離心管壁任意一側，縱向豎直向下剪，由離心管開口剪到管底部，橫向根據小鼠尾部根部粗細，在離心管一側剪出寬為0.5 cm左右的開口(圖1E)，再用膠布在管壁剪開的開口周圍貼上膠布(圖1F)，防止管壁開口毛刺劃傷小鼠。經過以上的操作，一個小鼠簡易束縛裝置基本制作完成，后續(xù)搭配離心管蓋、膠布、橡皮筋使用(圖1G)。

(2)使用方法

操作者左手持小鼠束縛裝置，裝置管口朝外，管底部朝自身，側壁間隙朝上。右手抓住小鼠尾部，將小鼠放在鼠籠上方或任一平面，用管口對準小鼠臀部，右手施力拖動小鼠尾巴在管壁間隙中滑行，沿著管壁間隙從管口縱行拉向管底，然后用離心管蓋抵住洞口，膠布貼于離心管蓋及其兩側管壁進行加固，即可把小鼠固定于裝置內且小鼠尾部暴露在管壁外(圖1H)。接著用橡皮筋箍緊管壁(圖1I)，既可以防止小鼠從管壁間隙中逃走也能限制小鼠在管內的活動空間。亦可不用離心管蓋抵住洞口，選用膠布繞1～2圈小鼠尾巴根部然后環(huán)繞管底周圍管壁幾圈即可固定小鼠于裝置內。該裝置只需操作者施力即可迅速把小鼠拖入管內，不需要等待引誘小鼠主動進洞，避免小鼠掙扎緊抓洞口耗費時間，提高實驗效率，非常方便。

圖1 束縛裝置的制作步驟Figure 1 Manufacturing procedure of the fixing device

(3)注意事項

①剪管壁間隙時，要注意間隙的寬度要適合小鼠的尾部粗細，間隙尺度要略大于尾部最粗端的尺度，但是不可以過大而讓小鼠鉆出。

②選擇離心管蓋抵住離心管口來固定小鼠時，要注意在離心管蓋上用剪刀插上孔。雖然管壁上方有一縱行貫穿的間隙，已經不影響管內空氣流通，但是保險起見需在離心管蓋上用剪刀插上孔透氣，孔不能過大以防小鼠嘴巴伸出啃咬。為了離心管蓋能穩(wěn)固地抵住離心管口，可以用膠布貼于離心管蓋和兩側管壁進行加固。

③選擇膠布固定小鼠尾部于管壁時，用膠布繞小鼠尾巴根部1 ～ 2圈，勿緊，過緊會導致小鼠尾部血液不暢。正確操作是使膠布粘住鼠尾，余下膠布纏繞管底周圍管壁幾圈，觀察鼠尾顏色，確定不影響尾部血循即可，原則是固定而不過緊。

④橡皮筋捆于管壁，不要太靠近小鼠頭部處，容易被咬斷，最佳位置是捆于小鼠軀干處的管壁。如果沒有皮筋，可用膠布替代捆于管壁，膠布繞過管壁間隙接觸小鼠毛發(fā)處容易粘住動物毛發(fā)，所以另撕一小節(jié)膠布，反向貼于膠布粘性一側，使不粘的一側接觸動物毛發(fā)，從而保護小鼠安全。

⑤為了加強小鼠保定束縛效果可以既用離心管蓋抵住管口又用膠布粘住小鼠尾部固定于管壁，根據操作者需求進行選擇。如果只是短暫的保定束縛，可以只選擇用離心管蓋抵住管口，如果是為了給予長時間束縛應激，可以把兩種固定方式結合，加強固定效果。

⑥可以根據小鼠的身長對離心管管壁進行修剪。當離心管管壁過長，可以用剪刀適當裁剪管壁長度來匹配小鼠的身長，盡量縮小小鼠的活動空間。修剪后的管口直徑仍然略小于離心管蓋的直徑，然后用離心管蓋罩住管口，并且用膠布加固離心管蓋與管壁的連結。

(4)裝置適用范圍

①尾靜脈采血、注射。

小鼠的尾部暴露于離心管外，便于操作者進行尾靜脈采血、注射。

②束縛應激模型制作。

例如把產后小鼠固定于裝置內限制其行動，每天給予3 h的束縛應激，連續(xù)造模21 d即可制備產后束縛應激小鼠模型[9]。

③其它。

在管壁所需要的部位剪洞，進行腹腔注射或者背部注射。

1.2.2 小鼠產后束縛應激模型建立

(1)造模方法

小鼠適應性喂養(yǎng)一周后，以1只雌性搭配2只雄性小鼠交配的方式，將小鼠放在同一鼠籠4 d進行交配，4 d后取出雄性小鼠，單獨飼養(yǎng)妊娠成功的雌性母鼠直至實驗結束。在母鼠產后第2天，將母鼠移出鼠籠，母子分離，把母鼠裝于于自制的束縛裝置(后文詳述)，每天上午9點至中午12點，連續(xù)束縛3 h，結束后把母鼠移回原鼠籠，每天1次連續(xù)3周，直到斷乳。

(2)分組與干預

將相似體重的產后母鼠分為2組，正常組(Control)與產后應激組(immobilization stress， IS)，每組8只。產后每天記錄母鼠體重與攝食量和仔鼠體重。對于產后應激組母鼠，產后第2天開始，在母子分離基礎上，每天給予3 h束縛應激，對正常組母鼠不操作。在產后第22天，通過紅外線計數(shù)器，測算母鼠運動量，之后人道地處死母鼠，摘取胃與下丘腦。

(3)檢測指標與方法

①RT-qPCR 法測基因的mRNA相對的表達量

采用逆轉錄實時聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)的方法測定胃內ghrelin,5-HT2b受體mRNA表達水平和下丘腦內ghrelin, 5-HT2c受體的mRNA水平。使用RN easy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)從樣本組織中分離出總RNA，利用Improm-IITM逆轉錄系統(tǒng)(Promega, Madison, WI, USA)合成cDNA。使用表1列出的引物和QuantiFast SYBR Green RT-PCR(Roche，Swiss)試劑盒進行qPCR分析。循環(huán)參數(shù)設計在95℃初始化5 min,然后在95℃下10 s為周期進行連續(xù)40個循環(huán)的變性、延伸、擴增，最后在60℃退火30 s。根據其熔解曲線，以GAPDH基因作內參基因，使用2-ΔΔCt方法測定相對mRNA表達。

②蛋白質印跡(Western blot)法測蛋白的總量

將樣本組織放入RIPA緩沖液中裂解。將裂解物進行聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)并電轉移至聚偏二氟乙烯膜。將該膜放入1%脫脂奶粉中封閉1 h，并在4℃下分別用抗生長素釋放肽，抗5-HT2b受體，抗5-HT2c受體?？垢视腿?-磷酸脫氫酶(GAPDH)孵育過夜，再與過氧化物酶綴合的二抗孵育后，通過增強的化學發(fā)光底物檢測條帶信號信號值，并使用Image Studio軟件相對定量分析結果。

表1 實時PCR引物序列Table 1 Primer sequences for Real-time PCR

③免疫組織化學染色法

將組織樣品固定在多聚甲醛中，然后石蠟包埋切片。脫蠟和脫水后，將切片浸入3%過氧化氫中，用來阻斷內源性過氧化物酶活性，再用pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液進行抗原的修復。在4℃下將切片分別與生長素釋放肽，5-HT2b受體、5-HT2c受體的抗體孵育過夜，然后于室溫下和二抗孵育1 h。3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液應用于切片，并用蘇木精復染細胞核。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 產后束縛應激母鼠運動量的變化

如圖2所示通過紅外線感知計數(shù)器測量產后第22天母鼠10 min的運動量，發(fā)現(xiàn)壓力組母鼠的運動量少于正常組母鼠(P< 0.01)，兩者運動量的差異具有顯著性。

2.2 產后束縛應激母鼠體重與攝食的變化

兩組母鼠產后記錄體重與攝食，如圖3所示。應激組母鼠的體重與攝食總體上低于正常組母鼠(P< 0.05；P< 0.01；P< 0.001)，差異具有顯著性。產后母鼠在束縛應激壓力作用下體重與攝食減少。

2.3 產后束縛應激母鼠胃與下丘腦內相關基因的變化

圖4顯示在母鼠產后第22天，采用RT-qPCR方法，檢測胃和下丘腦中與情緒以及代謝相關基因的mRNA表達水平?？梢钥吹较虑鹉X中的5-HT2c受體與胃中5-HT2b受體在應激組的表達要低于正常組(P< 0.001)，下丘腦中的ghrelin和胃中ghrelin在應激組的表達要高于正常組(P< 0.001)，差異具有顯著性。

圖5顯示免疫組織化學染色法和蛋白質印記法檢測母鼠產后第22天胃內ghrelin、5-HT2b受體和下丘腦內ghrelin和5-HT2c受體的表達水平。圖表顯示胃和下丘腦標本中應激組的ghrelin蛋白表達表達高于正常組(P< 0.001)，應激組胃內5-HT2b受體(P< 0.001)和下丘腦中5-HT2c受體(P< 0.05)的蛋白表達低于正常組，差異具有顯著性。

注：與正常組母鼠運動量比較，**P< 0.01。圖2 母鼠運動量的變化Note. Comparison of exercise amount with maternal mice in control group,**P < 0.01.Figure 2 Changes of exercise amount in maternal mice

注：與正常組母鼠體重與攝食比較，*P < 0.05,**P < 0.01,***P< 0.001。圖3 母鼠體重與攝食的變化Note. Compared with the weight and food intake of maternal mice in control group,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001.Figure 3 Changes of body weight and food intake in maternal mice

注：與正常組相關基因mRNA表達相比，***P < 0.001。圖4 應激影響母鼠胃與下丘腦內相關基因的變化Note. Compared with mRNA expression of related genes in control group,***P< 0.001.Figure 4 Changes of related genes in stomach and hypothalamus

注：通過免疫組織化學染色法和蛋白質印記法檢測基因表達，**P < 0.01, ***P < 0.001。圖5 應激影響母鼠胃與下丘腦內相關基因的變化(×200)Note. Detection of gene expression by immunohistochemical staining and Western blot, **P < 0.01, ***P < 0.001.Figure 5 Changes of related genes in stomach and hypothalamus(×200)

2.4 產后應激母鼠對子代的影響

應激母鼠產后記錄仔鼠的體重，如圖6所示，應激組母鼠的仔鼠體重和身長低于正常組母鼠仔鼠(P< 0.001)，差異具有顯著性。雖然是給予母鼠束縛應激，但是也對小鼠造成了發(fā)育不良。體重增長曲線持續(xù)觀察10周，應激組仔鼠體重仍沒有追上正常組仔鼠(P< 0.01)。表明母鼠產后應激會影響子代發(fā)育，導致仔鼠持續(xù)的生長遲緩，造成子代低體重與營養(yǎng)不良。

另外在第8周應激組仔鼠的運動量高于正常組仔鼠(P< 0.01)，差異具有顯著性，表明仔鼠長大后有多動的傾向。

注：正常組母鼠的子代與應激組母鼠的子代比較發(fā)育狀況，**P < 0.01, ***P < 0.001。圖6 產后應激母鼠對子代的影響Note. Comparison of offspring development between normal and stressed maternal mice,**P < 0.01, ***P < 0.001.Figure 6 Effect of postpartum stressed maternal mice on the offspring

3 討論

使用本文自制的束縛裝置制作小鼠產后束縛應激模型，具有低體重低攝食，ghrelin高表達，5-HT2受體低表達的特征，并且能造成子代生長發(fā)育遲緩。本課題組之前的實驗[10-12]，同樣采用此束縛裝置制作產后束縛應激小鼠模型，與正常組相比，應激母鼠的體重與攝食同樣呈現(xiàn)減少趨勢，母鼠胃和下丘腦內ghrelin表達量升高，下丘腦中的5-HT2c受體與胃中5-HT2b受體表達下降，并且應激組母鼠的仔鼠體質量同樣低于正常組母鼠的仔鼠體質量。以上實驗證明該裝置制作的產后束縛應激模型具有穩(wěn)定性和可重復性。

近些年來，一些研究表明ghrelin在情緒調節(jié)中起著重要作用，例如自殺未遂患者的血清ghrelin水平顯著增加[13]、側腦室注射ghrelin可增加雄性幼年大鼠抑郁樣行為[14]、抑郁癥患者血清內高ghrelin表達，并且隨抑郁的嚴重程度加重而表達增加[15]。

許多研究已經證實5-羥色胺(5-HT) 與情緒障礙相關[16]，例如恐懼、焦慮、抑郁等不良情緒。據報道，低血清素活性可能導致許多心理障礙，如沖動性，攻擊性和自殺意念，并且血清素能系統(tǒng)和生長素釋放肽之間存在相互作用[17-19]。

在人類和動物模型中，血清素(又名5-羥色胺或5-HT)的攝取與焦慮、抑郁等情緒密切相關，是廣泛使用的抗抑郁和抗焦慮藥物的作用位點[20]。5-HT的受體具有許多亞型，有研究報道抑郁癥患者較正常人腦內5-HT受體的數(shù)量偏低且敏感性下降[21]，其中5-HT2受體與抑郁癥密切相關[22]。5-HT2b受體主要分布于周圍組織，有研究顯示5HT2b受體的表達與抑郁癥狀呈相關性，在帕金森伴抑郁小鼠的腦皮質中5-HT2b受體表達下降[23]。在慢性應激導致快感缺乏的小鼠中，5-HT2b受體表達顯著降低[24]。激活胃內5-HT2b受體能夠抑制ghrelin的分泌[25]。5-HT2C受體是5-HT受體的另一種亞型，廣泛分布于中樞神經，在抑郁癥新治療策略的開發(fā)受到重要的關注[26]。5-羥色胺再攝取抑制劑治療對5-HT2C受體的間接激活，可能有助于改善厭食和焦慮作用[27]。

本文介紹的產后小鼠束縛應激模型具有低體重低攝食，胃與下丘腦以及血清內ghrelin表達量增加，5-HT2受體等基因表達量減少，運動量減少等抑郁樣癥狀，能造成子代生長發(fā)育遲緩并有多動傾向，可供產后應激疾病等研究。并且多次實驗[8,10-11,28]證明此束縛裝置對于束縛應激模型的造模是具有可重復性和穩(wěn)定性。

此文章講述的自制簡易小鼠束縛裝置，材料準備方便，制作簡便，成本低廉，體積小巧，便于收納保存。該裝置只需選取合適容量規(guī)格的離心管，能夠對大小不同的實驗鼠進行固定限位。只需操作者施力即可迅速把實驗鼠拖入管內，不需要等待實驗鼠主動進洞，避免實驗鼠掙扎緊抓洞口耗費時間，有利于提高實驗效率。使用該裝置進行尾靜脈采血或注射，能保護實驗人員不被小鼠咬傷，且透明管壁有助于觀察小鼠的情況。

除了運用于小鼠束縛應激模型的制備外，該裝置還可以用于尾靜脈采血、注射。根據實驗鼠身型大小選擇合適容量的容器，用上述方法制作簡易束縛裝置，既能運用于小鼠又能用于大鼠。以上全部內容就是產后束縛小鼠應激模型以及束縛裝置的制作方法介紹，供實驗人員借鑒與使用。