陶紹能 王瑩瑩 楊軍 程光華 戴云海 呂坤

皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院1核醫(yī)學科，2中心實驗室（安徽蕪湖241000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是最常見 的癌癥之一，其病死率居世界男性和女性惡性腫瘤的第三位［1］。報告表明，CRC 患者的5年相對生存率從90%以上（早期患者）到略＞10%（第四階段患者）不等［2］。因此，篩選早期CRC 生物標志物對于預防和正確管理疾病進展和控制CRC 誘導的病死率至關重要［3］。近年來，無創(chuàng)生物標志物的研究已成為一個熱點。然而，常用的血清腫瘤生物標志物CEA 和CA19-9，對早期CRC 診斷具有有限的敏感性和特異性，并產(chǎn)生有爭議的預后價值［4-5］。因此迫切需要具有高靈敏度和特異性的新型無創(chuàng)分子診斷生物標志物。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）包含長度超過200 nt RNA，蛋白質(zhì)編碼能力有限或者無蛋白質(zhì)編碼能力的一類轉(zhuǎn)錄物。循環(huán)中的LncRNAs 已被證實在結(jié)直腸癌中具有診斷價值［6-8］，這表明LncRNA 作為腫瘤生物標志物具有巨大的潛力。SNHG11（small nucleolar RNA host gene 11）位于人類染色體20q11.23，長4 268 bp，屬于LncRNA［9］?，F(xiàn)有對LncRNA 研究的文獻資料大部分是對患者組織樣本的，對外周血中LncRNA的研究甚少。本研究擬通過檢測結(jié)直腸癌患者血清中SNHG11 的表達水平，并進一步分析其與臨床病理資料之間的關系，從而探索SNHG11 作為結(jié)直腸癌的一種生物標記物的可能性及其臨床應用。

1 資料與方法

1.1 一般資料我院住院的結(jié)直腸癌患者（CRC組）70 例，平均年齡（62.2±11.6）歲。其中男51 例，平均年齡（63.6 ± 11.1）歲；女19 例，平均年齡（58.4± 12.3）歲。結(jié)直腸良性疾?。–BD 組）35 例，平均年齡（55.7 ± 11.2）歲。其中男23 例，平均年齡（54.0±10.6）歲；女12 例，平均年齡（56.4±9.7）歲。所有病例均有病理診斷，其術前未接受任何放化療治療。同時選取接受體檢的健康人（NC 組）35 例作為對照組，平均年齡（59.9±12.6）歲。其中男23 例，平均年齡（63.9 ± 11.8）歲；女12 例，平均年齡（52.4±10.8）歲。

1.2 主要儀器及試劑Trizol 試劑（北京天根生化科技有限公司）；RNA 提取試劑盒、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA 熒光定量試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；LncRNA SNHG11 與內(nèi)參基因β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。主要儀器包括臺式低溫高速離心機（美國Thermo 公司），RNA 濃度檢測儀（美國Thermo 公司），熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 樣本收集清晨空腹抽取靜脈血5 mL，4 h 內(nèi)在4 ℃，16 000 ×g，離心10 min 取上清液至無RNA酶的EP 管中；為更加徹底去除血清中雜質(zhì)成分對試驗結(jié)果的影響，4 ℃，1 600×g再離心10 min。將分離的血清置于無RNA 酶的EP 管中，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA 提取將分離的血清置于冰上融化解凍后，嚴格按照試劑說明書提取總RNA。將提取的總RNA 用分光光度儀測定其濃度和純度。選取A260/A280在1.8～2.0 的樣品進行反轉(zhuǎn)錄，反應程序：25 ℃10 min，42 ℃45 min，70 ℃15 min。cDNA樣本置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 qRT-PCR 檢測LncRNASNHG11 的表達以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，采用qRT-PCR 進行擴增反應。SNHG11 引物序列：上游5′-GTGTGAGGATGTCCCTGGAT-3′，下游5′-CCCCAAACAATCATGAGGAG-3′；內(nèi)參β-actin 引物序列：上游5′-AAGCCACCCCACTTCTCTCTAA-3′，下游：5′-AATGCTATCACCTCCCCTGTGT-3′。預變性95 ℃10 min；PCR反應以95 ℃15 s、58 ℃30 s、72 ℃10 s 為一個循環(huán)，進行45 個循環(huán)：溶解曲線分析95 ℃30 s、70 ℃1 s、95 ℃1 s。采用ΔCt 法計算各目的基因的相對表達值，作為評估目的基因在疾病組和健康對照組中表達差異的指標。ΔCt=CtSNHG11-Ctβ-actin，ROC 曲線采用2-ΔΔCt。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學處理，GraphPad Prism 5.0 軟件進行繪圖。數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗，兩組之間比較采用Mann-WhineyU檢驗，三組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清LncRNA SNHG11 在良惡性結(jié)直腸疾病中的表達與健康對照組比較，SNHG11 在結(jié)直腸癌中明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（Z=-5.583，P＜0.01），而與結(jié)直腸良性疾病差異無統(tǒng)計學意義（Z=-1.100，P= 0.272）。結(jié)直腸良惡性疾病差異有統(tǒng)計學意義（Z=-6.613，P＜0.01），見圖1A。SNHG11 在TNMⅠ/Ⅱ期中的表達較健康對照組明顯升高（Z=-4.667，P＜0.01），但是在TNMⅠ/Ⅱ期與TNM Ⅲ/Ⅳ期之間差異無統(tǒng)計學意義（Z=-1.233，P=0.218），見圖1B。

2.2 結(jié)直腸癌患者血清SNHG11 水平與臨床病理參數(shù)的關系結(jié)直腸癌患者血清SNHG11 與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、TNM 分期、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)之間無明顯相關性（P＞0.05）。見表1。

2.3 血清SNHG11 對結(jié)直腸癌診斷價值的分析見圖2。血清SNHG11 診斷結(jié)直腸癌的AUC 優(yōu)于傳統(tǒng)的腫瘤標志物CEA、CA199（0.866、0.714、0.638），診斷敏感性明顯高于CEA 和CA199，分別為0.786、0.457、0.343，但是特異性略低于CEA、CA199，分別為0.871、0.929、0.929。聯(lián)合CEA 檢測可略提高檢測效能（AUC = 0.895），提高檢測的靈敏度。見表2。

圖1 SNHG11 在結(jié)直腸癌患者血清中的表達Fig.1 Expressionlevelof SNHG 11 in serum of patients with colorectal cancer

圖2 血清SNHG11 與CEA、CA199 診斷結(jié)直腸癌ROC 曲線圖Fig.2 ROC curve of serum SNHG11，CEA and CA199 in the diagnosis of colorectal cancer

表1 結(jié)直腸癌患者血清SNHG11 水平與臨床病理參數(shù)的關系Tab.1 The relationship between serum SNHG11 level and clinicopathological parameters in patients with colorectal cancer ±s

表1 結(jié)直腸癌患者血清SNHG11 水平與臨床病理參數(shù)的關系Tab.1 The relationship between serum SNHG11 level and clinicopathological parameters in patients with colorectal cancer ±s

病理參數(shù)年齡≥60 歲＜60 歲性別男 女TNM 分期Ⅰ/Ⅱ期Ⅲ/Ⅳ期病理類型潰瘍型隆起型浸潤型淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有 無遠處轉(zhuǎn)移有 無例數(shù)40 30 51 19 32 38 54 13 3 33 37 11 59 SNHG11（ΔCt）3.623±0.956 3.860±1.251 3.647±1.053 3.932±1.189 3.484±1.089 3.926±1.063 3.602±1.091 4.192±1.103 3.900±0.557 3.997±1.109 3.481±1.027 3.756±1.162 3.555±0.570 Z/H 值-0.570-0.767-1.233 2.439-1.619-0.525 P 值0.569 0.443 0.218 0.295 0.105 0.600

表2 SNHG11 在結(jié)直腸癌中的診斷效能分析Tab.2 Analysis of diagnostic efficacy ofSNHG11 in colorectal cancer

3 討論

LncRNA 是一種調(diào)節(jié)性RNA，在眾多細胞途徑中起著關鍵作用。全基因組分析發(fā)現(xiàn)許多LncRNA在惡性組織和正常組織之間有差異表達［10-11］，武雪亮等［12］研究發(fā)現(xiàn)LncRNA HOTAIR mRNA 在結(jié)直腸癌組織中的表達明顯較正常結(jié)直腸組織高，與臨床病理特征及預后關系密切。此外，腫瘤衍生的LncRNA 可以在多種生物體液中檢測并保持穩(wěn)定［10，13］，這些表明LncRNA 有可能作為癌癥診斷和預后的無創(chuàng)生物標記物。

SNHGs 在各種腫瘤中得到了廣泛的研究，例如，SNHG 6 通過miR-101-3p 和Wnt/β-catenin 信號通路促進結(jié)直腸癌的進展［14］。SNHG8 通過對miR-149-5p 的應答促進肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，并預測肝癌的復發(fā)［15］。SNHG1 通過miR-448/IDO 調(diào)節(jié)Treg細胞分化，影響乳腺癌的免疫逃逸［16］。SNHG2 被稱為GAS5，是一種腫瘤抑制基因，GAS5 的下調(diào)與CRC 的惡性程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關［17］。SNHG14 在乳腺癌中高表達并通過miR-144/CEP55信號軸促進乳腺癌細胞的增殖和遷移［18］。SNHG11位于人類染色體20q11.23，屬于LncRNA。但是SNHG11 在結(jié)直腸疾病中的報道較為罕見。本研究結(jié)果顯示，血清SNHG11 不但在CRC 患者與健康對照相比明顯升高，而且與結(jié)直腸良性疾病相比也升高，這在臨床上將有利于根據(jù)SNHG11 血清水平來判斷結(jié)直腸疾病的嚴重程度，從而采取相應的治療措施改善結(jié)直腸疾病患者的預后。同時，本研究發(fā)現(xiàn)CRC 患者在TNM Ⅰ/Ⅱ期時其SNHG11 血清水平較健康對照升高，說明其在早期診斷方面可能具有一定的價值。但是，其在CRC患者中的表達水平并不隨腫瘤的發(fā)展而升高，其具體機制不明，有待于進一步的研究。

有文獻報道［19］SNHG11 在組織中的表達水平與結(jié)直腸癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期相關。最近，XU 等［20］報道血漿SNHG11 在CRC 中可作為早期診斷和預后的一個新的生物標志物。但是在本研究中血清SNHG11 與臨床相關病理參數(shù)之間并無相關性，這可能與患者標本來源不同、腫瘤異質(zhì)性、研究病例的多少等多種因素有關。

通過ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清SNHG11 在結(jié)直腸癌中的診斷效能明顯優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標志物CEA、CA199（AUC = 0.866、0.714、0.638），其靈敏度可達78.6%，特異性可達87.1%，聯(lián)合CEA 可提高其診斷效能（AUC = 0.895），聯(lián)合CA199 對診斷效能提高不顯著。但是本研究未能觀察治療前后血清SNHG11 在血清中的變化，無法判斷其是否可作為治療監(jiān)測指標，后續(xù)將擴大病例進一步研究其在早期診斷及治療監(jiān)測方面的作用。

總之，SNHG11 在結(jié)直腸癌患者血清中異常高表達，可作為結(jié)直腸癌新的診斷循環(huán)分子標志物，與CEA 聯(lián)合診斷可提高結(jié)直腸癌的診斷效能。