孫博文 楊孟雪， 劉軍 周雪 李飛 楊波

1遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科（貴州遵義563000）；2復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（上海200240）

Graves ?。℅raves disease，GD）是最常見的器官特異性自身免疫疾病之一，部分病因是由于自身對甲狀腺抗原的免疫耐受減弱，從而導(dǎo)致致病性自身反應(yīng)性T 和B 淋巴細(xì)胞攻擊甲狀腺濾泡細(xì)胞。其主要特征為血清中存在針對甲狀腺細(xì)胞的TSH 受體抗體（TRAb）、甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）及甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）。而腸道微生物群紊亂可能是潛在的病因之一，有研究發(fā)現(xiàn)在橋本甲狀腺炎患者中，檢測到十二指腸遠(yuǎn)端腸微絨毛厚度的變化和相鄰微絨毛間隙的增加，腸道黏膜屏障通透性增加［1］，而毒素、抗原、細(xì)菌代謝物、甚至細(xì)菌易位，從腸道進(jìn)入血液引起持續(xù)炎癥刺激可以觸發(fā)自身免疫，引發(fā)自身免疫性疾?。?］。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群對于維持宿主的營養(yǎng)、代謝和免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用，腸道菌群紊亂已被證明在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［3-5］。而腸道菌群紊亂與Graves 病的相關(guān)研究目前國內(nèi)外鮮有報(bào)道，因此，基于以上因素本研究以Graves 病患者為研究對象，通過細(xì)菌16S rRNA 擴(kuò)增、測序、生物學(xué)分析，探討疾病狀態(tài)下的腸道微生物組成和結(jié)構(gòu)的特征，有助于對疾病的發(fā)病機(jī)制提出新的見解。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2018年9月至2019年2月期間就診于遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科18 例初診未經(jīng)過任何治療的Graves 病患者納入Graves病組（GD 組），同期于體檢中心體檢健康者11 例作為正常對照組（NC 組）。（1）GD 組納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照2008年中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)會《中國甲狀腺疾病診治指南》，且未經(jīng)過任何治療；②自愿參與并配合該研究，簽署相關(guān)知情同意書。（2）NC 組納入標(biāo)準(zhǔn)：①無Graves 病及其他器質(zhì)性病變；②實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢驗(yàn)（血、尿、便常規(guī)，肝腎功能、血脂、血糖、C-反應(yīng)蛋白等）及檢查（胸片、心電圖、腹部常規(guī)彩超）未見明顯異常；③年齡、性別相匹配，并自愿參與配合該研究，簽署相關(guān)知情同意書。（3）所有受試者排除標(biāo)準(zhǔn)：①近1 個(gè)月來服用益生菌、益生元等微生態(tài)制劑，抗生素、中草藥等可能對腸道菌群有影響的藥物；②近1 個(gè)月來合并感染相關(guān)性疾病及其他疾?。虎蹜?yīng)激狀態(tài)下。

1.2 標(biāo)本采集使用專用的糞便收集容器嚴(yán)格按照無菌觀念采集受試者新鮮大便約10 g，迅速放入無菌冰盒，轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃冰箱保存。

1.3 糞便菌群DNA的提取以微生物核糖體RNA能夠反映菌群組成和多樣性的目標(biāo)序列為靶點(diǎn)，根據(jù)序列中的保守區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。添加特異性Barcode序列，進(jìn)而對16S rRNA 基因可變區(qū)，即V3-V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并對目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收并進(jìn)行熒光定量。

1.4 Illumina MiSeq 測序采用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制備測序文庫，將合格的各序列進(jìn)行上機(jī)測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 OTU 劃分和分類地位鑒定以97%的序列相似度作為OTU（Operational Taxonomic Unit，可操作分類單元）劃分閾值，該閾值大致相當(dāng)于分類學(xué)中物種（Species）水平的序列差異，將豐度值低于全體樣本測序總量0.001%（十萬分之一）的OTU去除，根據(jù)每個(gè)OTU 在每個(gè)樣本中所包含的序列數(shù)，構(gòu)建OTU 在各樣本中豐度的矩陣。采用Greengenes數(shù)據(jù)庫對OTU 自門、綱、目、科、屬、種水平進(jìn)行分類地位鑒定并統(tǒng)計(jì)。

1.5.2 腸道群落的多樣性分析計(jì)算Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)并利用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行差異檢驗(yàn)，繪制稀疏曲線。使用R 軟件對Weighted 的UniFrac 距離矩陣分別進(jìn)行NMDS 分析，并二維排序圖描述群落樣本的結(jié)構(gòu)分布。根據(jù)OTU 劃分和分類地位鑒定結(jié)果，獲得每個(gè)樣本在門、綱、目、科、屬各分類水平的具體組成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及GraphPad Prism 5.0 作圖。正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位間距）表示，兩組間比較采用曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組一般臨床資料的比較GD 組及NC 組均在提供當(dāng)天相關(guān)檢查及檢驗(yàn)結(jié)果及符合排除標(biāo)準(zhǔn)情況下，留取糞便樣本。2 組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)相關(guān)指標(biāo)的比較，見表1。

表1 2 組一般臨床資料的比較Tab.1 Comparison of general clinical data between the two groups ±s

表1 2 組一般臨床資料的比較Tab.1 Comparison of general clinical data between the two groups ±s

項(xiàng)目性別（男/女，例）年齡（images/BZ_18_1084_2516_1109_2559.png±s，歲）BMI（images/BZ_18_1084_2516_1109_2559.png±s，kg/m2）正常對照組（n=11）5/6 28.91±10.82 21.27±1.42 Graves病組（n=18）7/11 36.67±11.167 20.31±1.69 P值-＞0.05＞0.05

2.2 2 組OTUs 的Venn 圖Illumina 測 序 共 測 得1 200 665 條高質(zhì)量序列，其中正常對照組中獲得477 940 條序列；Graves 病組中獲得了722 725 條序列；每個(gè)樣本平均含有（41 402 ± 6 733）條有效序列。根據(jù)獲得的OTU 豐度矩陣，使用R 軟件計(jì)算2 組OTU 的數(shù)量，并通過繪制OTUs 的Venn 圖直觀地呈現(xiàn)2 組所共有和獨(dú)有OTU 所占數(shù)量。NC 組特有409 個(gè)OTU，GD 組特有525 個(gè)OTU，其中兩組共有1 253 個(gè)OTU 相互重疊，見圖1。

2.3 2 組腸道菌群Alpha 多樣性分析側(cè)重于體現(xiàn)群落豐富度Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)，以及兼顧群落均勻度的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，兩組間Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)及Simpson 指數(shù)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。并繪制稀疏曲線，在圖中隨著測序深度加深，曲線逐漸趨于平緩，繼續(xù)增加測序深度已無法檢測到大量的尚未發(fā)現(xiàn)的新OTU，表明測序結(jié)果已足夠反映當(dāng)前樣本所包含的多樣性，見圖2。雖然2 組 間Chao1 指 數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指 數(shù)及Simpson 指數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但NC 組均大于GD組，表明Graves 病患者腸道菌群生物多樣性降低。

圖1 OTUs 的Venn 圖Fig.1 Venn diagram of GD and NC groups at OTU level

圖2 Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)的稀疏曲線圖Fig.2 The Rarefaction curve of the Chao1 and the Shannon Index between the two groups

2.4 2 組腸道菌群Beta 多樣性分析通過樣本距離矩陣降維處理簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，在低維坐標(biāo)系中對樣本重新排序描述樣本的分布特征，考察不同樣本之間群落結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)的相似性。在Weighted UniFrac NMDS 分析的樣本二維排序圖中2 組之間有一定的重疊，但整體GD 組和NC 組腸道群落結(jié)構(gòu)可以區(qū)分開，見圖3。

表2 2 組Alpha 多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)表Tab.2 Alpha diversity index data sheet between the two groups M（P25，P75）

圖3 Weighted UniFrac NMDS 分析的樣本二維排序圖Fig.3 Two-dimensional sorting Diagram of samples analyzed by Weighted UniFrac NMDS between the two groups

2.5 2 組腸道菌群在門及屬水平分類學(xué)組成分析在2 組糞便樣本中檢測到厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、蛋白菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、梭桿菌門（Fusobacteria）、Cyanobacteria、TM7、Tenericutes 等菌門，其中厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門及蛋白菌門為優(yōu)勢菌門，占細(xì)菌總數(shù)99%以上。用Metastats 統(tǒng)計(jì)學(xué)算法對門水平的各個(gè)分類單元在組之間的序列量差異進(jìn)行比較檢驗(yàn)得到GD 組厚壁菌門相對豐度低于NC 組（P＜0.05），而放線菌門相對豐度高于NC 組（P＜0.05），見圖4、5。

進(jìn)一步對屬水平的各個(gè)分類單元在組之間的序列量差異比較檢驗(yàn)，同樣利用Metastats 統(tǒng)計(jì)學(xué)算法進(jìn)行檢驗(yàn)結(jié)果顯示2 組屬水平有21 個(gè)分類單元具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，繪制如下圖呈現(xiàn)各分類單元在2 組內(nèi)的豐度分布。GD 病組雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、柯林斯氏菌屬（Collinsella）、Pediococcus、N09、02d06、Enterobacter 、Bulleidia、Weissella、Gemella、Granulicatella 相對于NC 組優(yōu)勢豐度分布（P＜0.05），而羅斯氏菌屬（Roseburia）、小桿菌屬（Dialister）、Thermus、Slackia、［Prevotella］、Oxalobacter、Mycoplana、Anaerostipes、Butyricimonas、Corynebacterium、Odoribacter 相對豐度低于NC 組（P＜0.05）見圖6。

圖4 2 組各門水平相對豐度柱狀圖Fig.4 Relative abundance histogram of the Phylum between the two groups

圖5 2 組間相對豐度＞0.1%門水平物種柱狀圖Fig.5 Histogram of relative abundance ＞0.1%of the Phylum between the two groups

3 討論

圖6 2 組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的屬相對豐度柱狀圖（P＜0.05）Fig.6 Histogram at Genus level between the two groups（P＜0.05）

近年來，隨著16S rRNA 基因高通量測序技術(shù)的發(fā)展，其以測序程度深和準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)目前被廣泛應(yīng)用于腸道菌群研究中。腸道菌群與自身免疫相關(guān)疾病之間的關(guān)系成為近年來的研究熱點(diǎn)，雖然Graves 病的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，但可以確定的是在遺傳易感性基礎(chǔ)上，環(huán)境因素導(dǎo)致的免疫功能紊亂已被證明是重要的組成部分，諸多研究表明腸道菌群與Graves 病相關(guān)聯(lián)。

本研究對初診Graves 病患者腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析并與健康人群進(jìn)行比較，通過對細(xì)菌16S rRNA 基因中的V3、V4 可變區(qū)進(jìn)行基因擴(kuò)增、測序，研究結(jié)果表明與體現(xiàn)腸道細(xì)菌群落豐富程度的Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)以及兼顧群落均勻度的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)Graves 病組均小于正常對照組，即Graves 病患者的腸道菌群多樣性相比較健康人群降低。

通過利用Metastats 分析得出2 組間厚壁菌門、放線菌門、Cyanobacteria、TM7、Thermi 有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中Cyanobacteria、TM7、Thermi 相對豐度極低（＜0.001%），且僅在極個(gè)別糞便樣本中檢出，GD 組患者中厚壁菌門豐度降低，放線菌門增高（P＜0.05）。進(jìn)一步分類鑒定至屬水平發(fā)現(xiàn)引起Graves 病組放線菌門水平顯著差異的物種為雙歧桿菌屬、柯林斯氏菌屬，并高于正常對照組（P＜0.05），而羅斯氏菌屬、小桿菌屬顯著低于正常對照組（P＜0.05）。

相關(guān)研究表明Th17 和Treg 細(xì)胞可能參與Graves 病的發(fā)病［6-7］，Graves 病和橋本甲狀腺炎患者外周血Th17 細(xì)胞及IL-17 比例高于對照組，在難治性Graves 病患者中，顯著高于緩解期患者［8］，Graves 眼病活動期患者血清IL-17 水平升高尤其明顯，Th17 細(xì)胞水平與Graves 眼病嚴(yán)重程度之間呈正相關(guān)［8-9］。Treg 細(xì)胞通過IL-10 和TGF-β等調(diào)節(jié)因子的分泌可以抑制自身反應(yīng)性T、B 細(xì)胞，而維持自身免疫耐受［10］。本研究發(fā)現(xiàn)腸道有益菌羅斯氏菌屬在Graves 病患者中顯著降低（P＜0.05），而研究發(fā)現(xiàn)羅斯氏菌屬可以通過分解難以消化的碳水化合物生產(chǎn)乙酸，丙酸，丁酸等短鏈脂肪酸（SCFA）［11］，很可能通過釋放SCFA 在腸道中的誘導(dǎo)Treg 細(xì)胞的產(chǎn)生并促進(jìn)功能［12］。其中丁酸鹽可以通過激活細(xì)胞受體HCA2，使Treg 細(xì)胞和IL-10產(chǎn)生增多，丙酸鹽和乙酸鹽能促進(jìn)外周Treg 細(xì)胞生成，特別是丁酸能增強(qiáng)Fox-P3 基因內(nèi)含子保守的非編碼序列中組蛋白H3 的乙酰化，從而促進(jìn)胸腺外產(chǎn)生Treg 細(xì)胞［13］。

本研究發(fā)現(xiàn)柯林斯氏菌屬在Graves 患者中顯著增多（P＜0.05），而該菌是一種可能誘導(dǎo)并加重自身免疫疾病的致病菌，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者腸道菌群中該菌豐度顯著升高，并與該病的發(fā)生相關(guān)［3］。研究發(fā)現(xiàn)柯林斯氏菌屬的豐度與具有促炎作用的IL-17 產(chǎn)生有關(guān)［3］，柯林斯氏菌屬通過降低上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白（ZO-1）的表達(dá)，誘導(dǎo)IL-17A、RORα和趨化因子CXCL 1 和CXCL 5 的表達(dá)增加，而RORα、CXCL 1 和CXCL 5 又可以調(diào)控IL-17 的產(chǎn)生［14-15］，并增加腸道黏膜屏障的通透性。因此，柯林斯氏菌屬可能通過改變腸道黏膜通透性及誘導(dǎo)IL-17 等細(xì)胞因子表達(dá)參與Graves病的發(fā)病。

本研究發(fā)現(xiàn)Graves 組顯著增高的另一種菌屬為雙歧桿菌屬，該菌的一些菌株被認(rèn)為是能對機(jī)體產(chǎn)生有利影響的益生菌，在治療急性感染性腹瀉、抗生素相關(guān)性腹瀉、潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征等疾病方面顯示了其療效［16-18］。雙歧桿菌及乳桿菌屬的某些特定菌株可以通過改變外周血淋巴細(xì)胞亞群來調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)的反應(yīng)［19］，但微生物沒有絕對的“好”與“壞”，有研究報(bào)道服用益生菌可通過產(chǎn)生Th1 導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，對患有Th1 介導(dǎo)的自身免疫性疾病的患者產(chǎn)生負(fù)面影響［20］。今年來有研究表明雙歧桿菌屬某些特定菌株可能通過分子模擬機(jī)制參與觸發(fā)自身免疫性甲狀腺疾病，在人血清中檢測到了一些針對雙歧桿菌抗原的特異性抗體，雙歧桿菌和乳酸菌屬某些特定菌株的氨基酸序列與甲狀腺過氧化物酶（TPO）和甲狀腺球蛋白（Tg）有共同的氨基酸序列，并可以選擇性地結(jié)合自身抗體，可能通過分子模擬機(jī)制參與觸發(fā)Graves ?。?1］。

綜上所述，本研究表明Graves 病患者中的腸道生物多樣性降低，我們推測柯林斯氏菌屬、雙歧桿菌屬的某些特定菌株及羅斯氏菌屬等細(xì)菌的改變可能與Graves 病發(fā)生發(fā)展有關(guān)，Graves 病患者腸道有益菌減少，而有害菌增多，腸道處于慢性炎癥狀態(tài)導(dǎo)致免疫炎癥軸失衡及腸道腸道黏膜屏障通透性增加，腸道細(xì)菌代謝物、細(xì)菌抗原、甚至細(xì)菌易位，從腸道進(jìn)入血液引起持續(xù)炎癥刺激可以觸發(fā)自身免疫，可能導(dǎo)致或者加重Graves 病，本研究為今后研究自身免疫性甲狀腺疾病的病因和診治提供新思路。

由于該研究Graves 病樣本量相對較少以及存在地區(qū)差異，而且糞便中的菌群并不能完全反映在腸道黏膜中定植的腸道菌群，所以本研究有一定的局限性。這需要擴(kuò)大樣本及進(jìn)一步從機(jī)制上研究腸道菌群在Graves 病發(fā)病中的作用。除了加大樣本量外，還需要建立動物模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并對相關(guān)差異菌導(dǎo)致的具體機(jī)制深入探討。