李俊彥 何來(lái)鵬 陸冰 葉劍 李友

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)中心（廣東湛江524001）

缺血性腦梗死約占腦卒中70% ～80%，其中TOAST 分型中的大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死（atherosclerotic cerebral infarction，ACI）是缺血性腦梗死常見類型［1-2］。ACI 最根本的病因是動(dòng)脈粥樣硬化，而各細(xì)胞之間縫隙連接的直接通訊失調(diào)是引起動(dòng)脈粥樣硬化的重要環(huán)節(jié)［3］。

許多研究表明，縫隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）分布于人體的各種細(xì)胞與組織中，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其參與內(nèi)皮細(xì)胞損傷后修復(fù)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞新陳代謝等病理生理過程，特別與腦缺血密切相關(guān)［4-7］。近年來(lái)，一些動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)Cx43 的異常表達(dá)與腦缺血再灌注損傷有關(guān)［8-10］。此外，CHEN 等［11］研究發(fā)現(xiàn)Cx43 的異常表達(dá)通過影響腫瘤壞死因子-α、白介素-6 及干擾素-γ等炎癥因子的表達(dá)，參與神經(jīng)炎癥和大動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理過程，進(jìn)而導(dǎo)致急性缺血性腦梗死的發(fā)生。加拿大學(xué)者FREITAS-ANDRADE 等［12］報(bào)道了急性缺血性腦梗死小鼠腦核心壞死區(qū)的Cx43表達(dá)水平于缺血3 h 后逐漸降低，提示過表達(dá)Cx43可作為治療早期急性缺血性腦梗死的潛在機(jī)制。

近年來(lái)，一些研究發(fā)現(xiàn)Cx43 基因多態(tài)性與心房纖顫、房間隔缺損及法洛四聯(lián)癥等心臟相關(guān)疾病易感性有關(guān)［13-15］。此外，GU 等［15］報(bào)道了Cx43 基因啟動(dòng)子區(qū)rs2071166 位點(diǎn)多態(tài)性可影響其啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而引起Cx43 基因mRNA 表達(dá)異常。迄今為止，從分子遺傳學(xué)角度研究Cx43 基因多態(tài)性與ACI 易感性的關(guān)系尚未見國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道?；诖耍狙芯恳詮V東漢族人群為研究對(duì)象，分析Cx43 基因啟動(dòng)子區(qū)rs2071166 多態(tài)性位點(diǎn)與ACI 易感性的關(guān)系，并進(jìn)一步研究ACI 患者外周血Cx43基因mRNA 表達(dá)水平的變化以及rs2071166 位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)Cx43 基因mRNA 表達(dá)水平的影響，為進(jìn)一步闡明Cx43 基因多態(tài)性與ACI 易感性的關(guān)系提供強(qiáng)有力的分子流行病學(xué)依據(jù)，為ACI 的診治打下理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2015年1月至2018年12月在廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)中心住院的初發(fā)的ACI 患者（病例組）300 例，所有患者均經(jīng)頭部磁共振檢查確診，根據(jù)TOAST 分型歸類為ACI，并剔除既往有其他類型的腦梗死或腦出血病史患者。對(duì)照組來(lái)源于我院健康體檢中心同期進(jìn)行體檢的健康者300 例。所有研究對(duì)象均為廣東漢族人群，并且相互之間無(wú)血緣關(guān)系。本次研究已通過廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。兩組的性別、年齡分別比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 病例組和對(duì)照組的臨床資料比較Tab.1 The comparison of clinical data between the case group and control group ±s

表1 病例組和對(duì)照組的臨床資料比較Tab.1 The comparison of clinical data between the case group and control group ±s

注：CHOL，總膽固醇；TG，甘油三脂；HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白

臨床資料年齡（歲）性別（男/女，例）吸煙史［例（%）］飲酒史［例（%）］高血壓病史［例（%）］2型糖尿病史［例（%）］空腹血糖（mmol/L）CHOL（mmol/L）TG（mmol/L）HDL（mmol/L）LDL（mmol/L）病例組（n=300）68.15±10.35 187/113 185（61.7）116（38.7）181（60.3）108（36.0）6.78±1.35 5.14±1.24 2.07±0.99 1.35±0.34 3.12±1.13對(duì)照組（n=300）67.67±10.14 174/126 92（30.7）94（31.3）85（28.3）25（8.3）5.52±1.19 4.89±1.16 1.85±0.86 1.48±0.42 2.82±1.02 t/χ2值0.574 1.175 58.001 3.546 62.239 66.549 12.13 2.550 2.906 4.167 3.413 P值0.566 0.278＜0.001 0.060＜0.001＜0.001＜0.001 0.011 0.004＜0.001＜0.001

1.2 基因型檢測(cè)抽取所有研究對(duì)象空腹外周靜脈血2 mL，收集于枸櫞酸鈉抗凝管，采用QIAamp DNA 提取試劑盒（QIAGEN 公司）抽提基因組DNA。運(yùn)用SNaPshot 技術(shù)［16］（Applied Biosystems，USA）分別對(duì)300 例病例組和300 例對(duì)照組的Cx43基因啟動(dòng)子區(qū)rs2071166 多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)，主要操作過程包括：PCR 反應(yīng)、單堿基延伸反應(yīng)和基因多態(tài)性位點(diǎn)序列測(cè)定，PCR 上游引物序列：5′-ATCTCCACCATTCCCTTTGTTA-3′；下游引物序列：5′-TGGGGAAGCATATAACCAGTTC-3′。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA 提取和熒光定量PCR隨機(jī)選取30 例對(duì)照組和30 例病例組，按照密度梯度離心法和TRIzol 法分別提取兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞總RNA。根據(jù)cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermal Scientificx）的操作步驟將單個(gè)核細(xì)胞總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用熒光定量PCR 方法測(cè)定兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞Cx43 mRNA相對(duì)表達(dá)量。Cx43 基因上游引物序列：5′-CAGCTTGTACCCAGGAGGAG-3′，Cx43 基因下游引物序列：5′-TGTCCCTGGCCTTGAATATC-3′；GAPDH 基因上游引物序列：5′-CACCAGGTGGTCTCCTCTGAC-3′，GAPDH 基 因 下游 引 物序 列：5′-GGTGGTCCAGGGGTCTTACTC-3′。每個(gè)cDNA 樣本重復(fù)檢測(cè)3 次熒光定量PCR，運(yùn)用2-ΔΔCt值計(jì)算Cx43 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)兩組等位基因和基因型頻率；采用χ2檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)兩組的等位基因和基因型頻率分布比較以及哈迪-溫伯格定律（Hardy-Weinburg equilibrium，HWE）檢測(cè)；采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示計(jì)量資料，兩組間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；采用Logistic 回歸分析校正兩組臨床資料后進(jìn)一步分析基因多態(tài)性與ACI 易感性的關(guān)系。本次研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用SPSS 19.0 軟件，均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 代表組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料病例組HDL 低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。病例組CHOL、TG、LDL、空腹血糖、2 型糖尿病患病率、高血壓患病率及吸煙率明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 兩組Cx43 基因rs2071166 多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率分布病例組和對(duì)照組的Cx43基因rs2071166 多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率分布均符合HWE（P= 0.134、0.415）。病例組Cx43 基因rs2071166 多態(tài)性位點(diǎn)的AA、AC 和CC 基因型頻率分別是56.7 %、35.0 %和8.3 %，對(duì)照組分別是67.7%、28.3%和4.0%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（AAvs.ACvs.CC：P= 0.008；顯性模型CC + ACvs.AA：P=0.005；隱性模型CCvs.AC+AA：P=0.027）；病例組Cx43 基因rs2071166 多態(tài)性位點(diǎn)C 等位基因頻率明顯高于對(duì)照組（25.8 %vs.18.2 %，OR=1.569，95%CI：1.190 ～2.069，P=0.001，見表2）。

表2 兩組Cx43 基因rs2071166 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較Tab.2 The comparison of the genotype and allele frequencies of the SNP rs2071166 between the case group and control group例（%）

2.3 Cx43 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較和rs2071166多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)Cx43 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響隨機(jī)選取的病例組30 例的外周血單個(gè)核細(xì)胞Cx43 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組30 例［（0.32 ±0.07）vs.（0.67±0.12）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。對(duì)對(duì)照組30 例rs2071166 多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與Cx43 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系分析提示CC + AC 基因型（C 等位基因攜帶者）的外周血單個(gè)核細(xì)胞Cx43 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯低于AA 基因型［（0.39±0.09）vs.（0.94±0.15），P＜0.05］，見圖2。

圖1 病例組和對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞Cx43 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較Fig.1 The comparison of the Cx43 mRNA relative expression in the mononuclear cells between the case group and control group

圖2 Cx43 基因rs2071166 位點(diǎn)不同基因型Cx43 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較Fig.2 The comparison of the Cx43 mRNA relative expression between the different genotypes of the SNP rs2071166 in the Cx43 gene

3 討論

腦動(dòng)脈粥樣硬化是引起ACI 的最常見病因，其中動(dòng)脈粥樣硬化具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確［17-18］。近年來(lái)，大量研究表明縫隙連接與動(dòng)脈粥樣硬化之間存在非常密切的關(guān)聯(lián)?？p隙連接廣泛分布于哺乳類動(dòng)物的各種細(xì)胞、組織和器官（紅細(xì)胞和骨骼肌除外），與血管平滑肌細(xì)胞的增生和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、修復(fù)密切相關(guān)，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制［19-21］。

縫隙連接蛋白目前在哺乳類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)至少有20 余種，并根據(jù)各自的分子量來(lái)命名。Cx43 編碼分子量為43 kDa 的多肽，包含有387 個(gè)氨基酸。LERNER 等［22］研究表明Cx43 的異常表達(dá)和動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性心臟病密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)學(xué)者劉坤等［23］研究發(fā)現(xiàn)大鼠大腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43 的表達(dá)參與急性腦缺血的病理過程。人Cx43 基因位于6 號(hào)染色體長(zhǎng)臂2 區(qū)，主要由1 個(gè)內(nèi)含子和2 個(gè)外顯子組成。近年來(lái)，WANG 等［24］研究發(fā)現(xiàn)Cx43 基因多態(tài)性與漢族人群高血壓病相關(guān)。洪濤等［25］報(bào)道了Cx43 基因S368 位點(diǎn)與腦血管痙攣有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)ACI 患者HDL 低于對(duì)照組，CHOL、TG、LDL、空腹血糖、2 型糖尿病患病率、高血壓患病率及吸煙率明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示血脂異常、糖尿病、高血壓病及吸煙與ACI 的發(fā)病密切相關(guān)。ACI 患者rs2071166 位點(diǎn)的基因型頻率分布與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中ACI 患者CC+AC 基因型（C 等位基因攜帶者）明顯高于對(duì)照組（OR=1.600，95%CI：1.147 ～2.232，P=0.005）。Logistic 回歸分析校正年齡、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓病史、2 型糖尿病史、空腹血糖、CHOL、TG、HDL 和LDL等多個(gè)混雜因素后，結(jié)果依然顯示rs2071166 位點(diǎn)顯性模型和隱性模型均與ACI 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)（P= 0.017、0.041）。此外，ACI 患者C 等位基因明顯高于對(duì)照組（OR=1.569，95%CI：1.190 ～2.069，P= 0.001）。這提示rs2071166 位點(diǎn)C 等位基因可能是ACI 易感性的危險(xiǎn)因素。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)ACI 患者Cx43 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），并且對(duì)照組C 等位基因攜帶者的Cx43 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯低于AA 基因型（P＜0.05）?；诖?，本文推測(cè)rs2071166 多態(tài)性位點(diǎn)的C 等位基因可能降低Cx43 基因的啟動(dòng)子活性，從而導(dǎo)致Cx43 mRNA 的表達(dá)下調(diào)。GU 等［15］通過斑馬魚研究發(fā)現(xiàn)攜帶rs2071166 位點(diǎn)CC 基因型的個(gè)體其Cx43 基因啟動(dòng)子活性明顯低于AA + AC 基因型，這與我們的推測(cè)相一致。

本研究從分子遺傳學(xué)角度研究Cx43 基因多態(tài)性與ACI 易感性的關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)rs2071166 位點(diǎn)C 等位基因可能是ACI 易感性的危險(xiǎn)因素。但是，本次研究仍存在以下幾點(diǎn)不足。首先，本研究病例-對(duì)照研究的樣本量相對(duì)少。其次，本研究只分析了Cx43 基因啟動(dòng)子區(qū)rs2071166 位點(diǎn)與ACI 易感性的相關(guān)性。基于此，后續(xù)會(huì)加大樣本量，并選取Cx43 基因其余多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)一步分析其與ACI 的關(guān)系。此外，針對(duì)不同時(shí)期、不同TOAST 分型的缺血性腦梗死分析其與Cx43 基因表達(dá)的相關(guān)性，會(huì)作并進(jìn)一步對(duì)啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行功能相關(guān)性研究。

綜上所述，Cx43 基因啟動(dòng)子區(qū)rs2071166 多態(tài)性位點(diǎn)與ACI 易感性密切相關(guān)，其中C 等位基因可能通過降低啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性導(dǎo)致Cx43 基因表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而參與ACI 的發(fā)病。