張永虎 張丹霞 曾良

1南華大學附屬第二醫(yī)院急診科（湖南衡陽421001）；2衡陽市中心醫(yī)院消化內科（湖南衡陽421001）

膿毒癥（sepsis）是一種主要由感染因素誘發(fā)、以炎癥系統(tǒng)過度激活為主要病理特征的全身炎癥反應綜合征，可導致多器官功能衰竭，是重癥醫(yī)學科最常見的疾?。?］。眾所周知，胃腸道是多器官功能障礙綜合征的始動器官。研究表明［2］，膿毒癥可以造成小腸黏膜上皮細胞損傷以及細胞間連接斷裂，從而導致腸屏障功能受損、腸道通透性增加。近年來，中醫(yī)中藥治療膿毒癥備受關注，且具有一定的療效，但大多數都缺乏或未完全闡明其具體作用機制。姜黃素（Curcumin）是從姜科姜黃屬植物根莖中提取出的一種天然活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及抗微生物等多方面的藥理作用［3］。有報道稱［4］，姜黃素可通過抑制炎癥反應改善脂多糖誘導的小鼠膿毒癥。也有研究顯示，姜黃素對腸道炎癥性疾病有一定的改善作用［5］。然而，姜黃素是否可改善膿毒癥所致腸損傷，目前鮮有報道。此外，核轉錄因子-κB（NF-κB）是炎癥起始的核心調控因子，不少中藥材可通過抑制NF-κB 通路活化達到抗炎效果［6］。因此，本實驗擬采用姜黃素預處理膿毒癥大鼠，探討其是否可通過調控TLR-4/NF-κB 通路對膿毒癥大鼠所致腸損傷發(fā)揮保護作用，旨為臨床治療膿毒癥相關急性腸損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物無特定病原體（SPF）級雄性SD 大鼠100只，鼠齡6 ～7周，體質量（260±20）g，由湖北省動物實驗中心提供，動物合格證編號：SCXK（鄂）2018-0018。溫度為24℃，濕度為50%，12 h 明暗交替，術前禁食12 h，不禁水。

1.2 主要試劑及儀器姜黃素（純度≥98%）購買于上海阿拉丁公司；蘇木素、伊紅購于上海碧云天生物公司；中性樹脂購于上海長島生物技術有限公司；一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒購于南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒購于美國R&D 公司；Claudin-1、ZO-1、TLR-4、MyD88、p-NF-κB p65（Ser536）、NF-κB p65 抗體購于美國Cell Signaling Technology 公司；正置顯微鏡、石蠟切片、攤片機購于徠克顯微系統(tǒng)有限公司；石蠟包埋機購于湖北泰維科技實業(yè)有限公司；全自動生化分析儀購自Beckman Coulter 公司；全自動數碼凝膠圖像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；酶標儀購于美國Thermo Fisher Science 公司。

1.3 方法

1.3.1 動物造模及分組處理100 只雄性SD 大鼠，適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機分成兩批，每批分4 組，即假手術組（sham）、模型組（Model）、姜黃素低劑量組（L-Cur，50 mg/kg）、姜黃素高劑量組（HCur，200 mg/kg）。第一批大鼠用于術后24 h 組織及血液樣本收集，每組10 只；第二批大鼠用于術后72 h 生存率統(tǒng)計，每組15 只。3%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，采用盲腸結扎穿孔術（CLP）制備膿毒癥大鼠模型［7］，假手術組大鼠只進行相同開腹手術操作，不進行盲腸結扎和穿孔。藥物組于造模前24 h 采用十二指腸插管給藥方式給予不同濃度姜黃素處理，低劑量組劑量為50 mg/kg，高劑量組劑量為200 mg/kg，假手術組和膿毒癥組注射等量生理鹽水。

1.3.2 取材及存活率統(tǒng)計第一批大鼠于術后24 h 采用摘眼球取血法取血，4℃下10 000×g 離心10 min，取上清保存?zhèn)溆?；隨后斷頸處死各組大鼠，取小腸組織保存?zhèn)溆?。第二批大鼠從術后即刻開始，每隔5 h 統(tǒng)計1 次各組大鼠死亡情況，72 h為終末觀察點。

1.3.3 HE 染色觀察小腸組織病理變化取小腸組織，洗凈后用10%甲醛固定24 h 后脫水處理，常規(guī)石蠟包埋，制作3～4 μm 石蠟切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察病理改變，采用Chui′s 評分［8］評價腸損傷情況。

1.3.4 ELISA 檢測血清中炎癥因子取各組大鼠血清，按照試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀在450 nm 波長處測定各孔的OD值，根據標準曲線計算血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β的含量。

1.3.5 小腸組織中NO、MDA含量及SOD活性檢測取小腸組織稱質量，碾磨至勻漿，4 ℃下10 000×g離心10 min，取上清液。按照試劑盒操作說明書加入相應試劑，孵育后測各樣品吸光度值，根據試劑盒操作說明書提供的計算公式分別計算NO、MDA含量及SOD 活性。

1.3.6 Western blot 檢測小腸組織中Claudin-1、ZO-1及TLR-4/NF-κB通路相關蛋白表達取各組大鼠小腸組織稱質量后加入預冷的組織蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑勻漿，冰上碾磨組織，4℃條件下12 000×g離心20 min，收集上清，采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取25 μg 蛋白進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，并將蛋白轉移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入Claudin-1、ZO-1、TLR-4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65（Ser536）抗體和β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜。次日，加入相應二抗室溫孵育1 h，ECL 試劑曝光顯影，在全自動凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影。目的蛋白的相對表達量用目的蛋白與β-actin 灰度值比表示。

1.4 統(tǒng)計學方法所有數據均采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；采用Kaplan-Meier 法進行生存分析，采用Log-rank Test 進行生存曲線間比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素對膿毒癥模型大鼠存活率的影響對各組大鼠術后72 h 內存活率進行統(tǒng)計，Kaplan-Meier分析顯示，Model 組大鼠中位生存期為45 h，L-Cur組大鼠中位生存期50 h，H-Cur 組大鼠中位生存期為65 h。Log-rank Test 分析顯示，H-Cur 組大鼠72 h 生存率顯著高于Model 組（P＜0.05），而L-Cur組與Model組比較則差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠術后72 h 生存曲線Fig.1 Survival curve of rats in each group at 72 h after operation

2.2 姜黃素對膿毒癥模型大鼠小腸組織病理結構的影響見圖2A，sham 組大鼠小腸顯示正常腸絨毛結構，排列規(guī)則，無充血及斷裂現象；Model 組大鼠小腸可見絨毛短細，排列紊亂，黏膜下及基層血管充血明顯，表現出淤血及出血，中性粒細胞浸潤；L-Cur 組大鼠小腸絨毛短細，排列紊亂，上皮下間隙擴張，伴隨黏膜上皮層與固有層的中度分離；H-Cur 組大鼠小腸可見腸絨毛排列尚規(guī)則，連續(xù)性完整，輕度充血伴上皮輕度抬高，出現輕度的上皮下間隙。見圖2B，與sham 組比較，Model 組Chui′s評分顯著增加（P＜0.05）；與Model 組比較，L-Cur組Chui′s 評分無顯著變化（P＞0.05），H-Cur 組Chui′s 評分顯著降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠小腸組織切片病理觀察（HE 染色，×200）Fig.2 Pathological changes of small intestine tissue sections（HE staining，×200）

2.3 姜黃素對膿毒癥模型大鼠血清中炎癥因子水平的影響見圖3，與sham 比較，Model 組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著增加（P＜0.05）；與Model 組比較，H-Cur 組血清中炎癥因子含量均顯著降低（P＜0.05），而L-Cur 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 姜黃素對膿毒癥模型大鼠小腸組織中氧化應激水平的影響見圖4，與sham 組比較，Model 組大鼠小腸組織中NO 水平、MDA 含量顯著增加（P＜0.05），SOD 活性顯著下降（P＜0.05）；與Model 組比較，H-Cur 組大鼠小腸組織中NO 水平、MDA 含量顯著降低（P＜0.05），SOD 活性顯著增加（P＜0.05），而L-Cur 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖3 姜黃素對膿毒癥大鼠血清炎癥因子含量的影響Fig.3 Effects of Cur on serum inflammatory cytokines in sepsis rats

圖4 姜黃素對膿毒癥大鼠小腸組織中NO 水平、SOD 活性及MDA 含量的影響Fig.4 Effects of Cur on the NO level，SOD activity and MDA content in intestinal tissues of sepsis rats

2.5 姜黃素對膿毒癥模型大鼠小腸組織中緊密連接蛋白Claudin-1 和ZO-1 表達的影響見圖5，與sham 組比較，Model 組大鼠小腸組織中Claudin-1和ZO-1 蛋白表達量顯著下調（P＜0.05）；與Model組比較，H-Cur 組大鼠小腸組織中Claudin-1、ZO-1蛋白表達量顯著上調（P＜0.05），而L-Cur 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.6 姜黃素對膿毒癥模型大鼠TLR-4/NF-κB信號通路的影響見圖6，與sham 組比較，Model 組大鼠小腸組織中MyD88、TLR-4 蛋白及p-NF-κB p65（Ser536）水平均顯著上升（P＜0.05）；與Model 組比較H-Cur 組大鼠小腸組織中MyD88、TLR-4 蛋白及p-NF-κB p65（Ser536）水平均顯著上升（P＜0.05），而L-Cur 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

膿毒癥是基于感染因素介導的全身炎癥反應綜合征（SIRS），在病程中表現為機體和病原體相互作用導致的促炎和抗炎反應失衡，涉及血管內皮細胞損傷、全身炎癥反應、免疫功能紊亂、凝血級聯(lián)反應障礙、氧化應激反應等［9-10］。在國內，運用中醫(yī)藥防治膿毒癥及多器官功能障礙綜合征（MODS）已成為一個重要的發(fā)展方向。本研究發(fā)現，高劑量姜黃素干預可顯著降低膿毒癥大鼠血清炎癥反應和小腸組織氧化應激水平，并促進小腸組織中緊密連接蛋白Claudin-1 和ZO-1 表達，抑制TLR-4/NF-κB 信號通路轉導，從而提高膿毒癥大鼠生存率，改善腸黏膜損傷，表明姜黃素可能通過調控TLR-4/NF-κB 信號通路改善膿毒癥模型大鼠急性腸損傷。

圖5 姜黃素對膿毒癥大鼠小腸組織中Claudin-1 和ZO-1蛋白表達的影響Fig.5 Effects of Cur on the proteins expression of Claudin-1 and ZO-1 in intestinal tissues of sepsis rats

圖6 姜黃素對膿毒癥大鼠小腸組織中TLR-4、MyD88、NF-κB p65 和p-NF-κB p65（Ser536）蛋白表達的影響Fig.6 Effects of Cur on the proteins expression of TLR-4，MyD88，NF-κB p65 and p-NF-κB p65（Ser536）in intestinal tissues of sepsis rats

CLP 是制備膿毒癥動物模型的金標準，其中穿孔處溢出的糞便可造成腹腔感染，同時缺血壞死的結扎段盲腸還可以誘導大量炎癥因子的釋放，進而形成SIRS［11］。有研究顯示［12-13］，采用CLP法制備膿毒癥大鼠模型，可于術后12、24 h 即可檢測到大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子水平顯著增高。本研究結果也顯示，術后24 h 模型組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β含量均顯著上升，然而采用高劑量姜黃素干預可顯著降低膿毒癥大鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β等含量，說明姜黃素可降低毒癥大鼠血清炎癥水平，與SILVA 等［14］研究一致。然而，姜黃素是否可改善膿毒癥所致急性腸損傷目前尚未明確。

有研究表明［15］，腸屏障功能障礙是導致膿毒癥多器官衰竭的主要原因之一。膿毒癥時，大量炎癥因子的刺激下iNOS 被誘導表達并在腸道內大量合成NO，同時被激活的中性粒細胞及單核/巨噬細胞將會釋放出大量活性氧簇，造成腸黏膜氧化損傷，引起腸道屏障功能障礙和腸通透性增加，從而導致腸道內細菌、細菌產物以及其他腔內內容物的移位，直接或間接導致遠處組織損傷或炎癥［16］。而姜黃素具有天然的強抗氧化能力，不僅能夠抑制氧自由基的生產，還能夠清除氧自由基以及抑制脂質過氧化［17］。本研究結果顯示，模型組大鼠小腸組織損傷嚴重，且NO 水平和MDA含量顯著增加，而SOD 活性顯著降低，說明膿毒癥模型大鼠小腸組織確實存在較高水平的氧化損傷。然而，高劑量姜黃素干預可改善膿毒癥大鼠小腸組織損傷，并降低小腸組織NO 水平和MDA含量，提高SOD 活性。說明姜黃素可降低膿毒癥大鼠小腸組織氧化損傷。OUYANG 等［18］研究也顯示，姜黃素可通過抑制炎癥反應和氧化應激損傷改善腸黏膜損傷。此外，正常腸道屏障主要由腸上皮細胞間連接形成的機械屏障和腸道內菌群平衡組成的生物免疫屏障等共同構成，能夠有效阻止腸道內菌群及內毒素等有害物透過腸黏膜進入血液。腸道上皮細胞間緊密連接主要是由跨膜蛋白Claudin 和緊密連接蛋白ZO-1 組成的復合體，位于細胞間連接的最頂端，組成了腸上皮下基質與腸腔間的第一道機械屏障［19］。大量研究顯示［10，20］，發(fā)生腸屏障功能障礙時，Claudin 和ZO-1 蛋白表達水平顯著降低。本研究結果顯示，模型組大鼠小腸組織中Claudin 和ZO-1 蛋白表達量下降，而高劑量姜黃素干預后可顯著上調小腸組織中Claudin和ZO-1 的表達。表明，姜黃素可改善膿毒癥大鼠腸屏障功能障礙。

TLR4/NF-kB 通路是調控炎癥反應的重要信號通路，在炎癥反應中TLR4 觸發(fā)細胞內信號傳導通路，經髓樣分化因子88（MyD88）激活NF-κB 轉入細胞核，從而誘導TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子的表達［21］。ZHAN 等［22］研究顯示，在膿毒癥誘導的腸屏障功能障礙大鼠腸組織中NF-κB 通路被顯著激活。而多項研究［23-24］表明，姜黃素可以阻斷TLR4/NF-kB 通路的轉導。然而，姜黃素是否通過該通路發(fā)揮改善膿毒癥相關急性腸損傷還未知。本研究中結果顯示，模型組大鼠小腸組織中TLR4、MyD88 蛋白以及磷酸化NF-κB 水平均顯著增加，表明，膿毒癥大鼠小腸組織TLR4/NF-kB 通路被顯著激活。而采用高劑量姜黃素干預后膿毒癥大鼠小腸組織中TLR4、MyD88 蛋白以及磷酸化NF-κB 水平均顯著下降，說明姜黃素可能是通過阻斷TLR4/NF-kB 信號通路，從而發(fā)揮減少膿毒癥相關的急性腸損傷作用。

綜上所述，姜黃素可以通過抑制TLR-4/NF-κB信號通路轉導，降低膿毒癥大鼠血清炎癥反應以及小腸組織氧化損傷，從而改善大鼠膿毒癥相關的急性腸損傷。本研究確定了姜黃素減輕膿毒癥相關的急性腸損傷的作用通路，但是具體的作用靶點未予涉及，需要后續(xù)的進一步研究。