華璐 郭楊 馬麗 傅佳 邱玲 趙姣妹 歐冊華

1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院（四川瀘州646000）；2西南醫(yī)科大學（四川瀘州646000）；3成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心（成都610000）

疼痛是一種令人不愉快的情感體驗，它與實際或潛在的組織損傷相關(guān)［1］，尤其慢性疼痛，嚴重困擾著人們的生活［2］。慢性疼痛性疾病包括神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）、脊柱源性疼痛、癌性疼痛、炎性相關(guān)性疼痛等［3］。據(jù)調(diào)查研究，在美國，慢性疼痛影響著25% ～30%的人口，其中65 歲以上人群疼痛發(fā)病率達60%左右［4］。與此同時，慢性疼痛性疾病通常與代謝性疾病、精神性疾?。òㄒ钟艉徒箲]）相并存［4-5］，嚴重影響人們的生存質(zhì)量。NP 為直接損傷神經(jīng)組織引起的慢性疼痛，是慢性疼痛中最為常見的一種，其導致疼痛時間可持續(xù)到組織傷愈后數(shù)月乃至數(shù)年［5］。據(jù)有關(guān)報道，NP 在普通人群中的患病率高達7% ～10%［6-7］。因此，慢性疼痛對患者的社會、經(jīng)濟、精神、身體健康產(chǎn)生較大影響，是一種較為普遍的公共衛(wèi)生問題，探討慢性疼痛特別是NP的治療方法及其機制具有重要的意義。普瑞巴林（pregabalin，PGB）是應(yīng)用于臨床治療NP 的一線用藥［8］，據(jù)報道，經(jīng)PGB 治療后睡眠干擾指數(shù)減少，VAS、NRS 評分結(jié)果均降低。PGB 可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與疼痛密切相關(guān)的電壓門控鈣離子通道蛋白，但這些作用機制尚未明確。因此，本研究首先構(gòu)建了常用的神經(jīng)病理性疼痛模型——CCI大鼠模型，并給予PGB 治療，同時進一步檢測與疼痛正相關(guān)的電壓門控鈣離子通道激活蛋白——瞬時陽離子通道亞家族V 成員1 蛋白受體（the transient receptor potential cation channel subfamily V member 1，TRPV1）在CCI 大鼠脊髓中的表達，以探討PGB 對CCI 大鼠模型的鎮(zhèn)痛效果及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組與CCI 模型鼠的建立

1.1.1 動物分組SPF 級雄性8 周SD 大鼠72 只，購自西南醫(yī)科大學城北動物實驗中心，并在西南醫(yī)科大學忠山校區(qū)動物中心飼養(yǎng)。所有動物實驗都經(jīng)過西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院實驗動物倫理管理委員會的批準，并根據(jù)西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院實驗動物有關(guān)的規(guī)定進行實驗。72 只大鼠隨機分為6 組：Sham 組（n= 12）為對照組，手術(shù)操作同CCI組，但不結(jié)扎神經(jīng)；CCI 組（n= 12）：結(jié)扎大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)復制慢性坐骨神經(jīng)縮窄損傷模型；CCI +PGB 組（n= 12）：復制CCI 動物模型，術(shù)后7 d 進行痛閾測定后給予普瑞巴林灌胃30 mg/（kg·d），連續(xù)7 d；CCI + CPZ 組（n= 12）：復制CCI 動物模型，術(shù)后7 d 進行痛閾測定后給予TRPV1 拮抗劑辣椒平腹腔注射2 mg/（kg·d），連續(xù)7 d；CCI + CPZ +PGB 組（n= 12）：復制CCI 動物模型，術(shù)后7 d 進行痛閾測定后先給予TRPV1 拮抗劑辣椒平腹腔注射2 mg/（kg·d），30 min 后再給予普瑞巴林灌胃30 mg/（kg·d），連續(xù)7 d；CCI+PGB+CP組（n=12）：復制CCI 動物模型，術(shù)后7 d 進行痛閾測定后先給予TRPV1 激動劑辣椒素腹腔注射30 μg/（kg·d），30 min 后再給予普瑞巴林灌胃30 mg/（kg·d），連續(xù)7 d。

1.1.2 CCI 模型鼠的建立腹腔注射6%水合氯醛（3 mg/kg）麻醉大鼠，右側(cè)大腿備皮，俯臥位固定于手術(shù)臺，術(shù)區(qū)消毒鋪巾，平行于股骨下方3 ～4 mm處做一約1 cm 左右的皮膚切口，游離皮膚，鈍性分離，暴露坐骨神經(jīng)，游離坐骨神經(jīng)干大約10 mm，將4 根浸泡于生理鹽水的4-0 絲線從坐骨神經(jīng)下方穿過，打四個雙節(jié)，每個節(jié)間隔約1 mm。節(jié)的松緊度以可以看到肌肉短暫的抽搐、線不會在坐骨神經(jīng)上滑動為宜，后逐層縫合肌肉、皮膚。Sham組只是分離暴露坐骨神經(jīng)但不進行結(jié)扎，余操作相同。大鼠模型復制成功后可見大鼠手術(shù)側(cè)活動時出現(xiàn)跛行，休息時足不接觸地面，足內(nèi)收，外翻，震顫等。Sham 組大鼠術(shù)后未見異?；顒印⑦\動障礙等表現(xiàn)。

1.2 大鼠機械痛閾測定通過Von Frey Filament感覺測試器測定大鼠足部機械痛閾，測定3 次，取均值。當發(fā)生模糊反應(yīng)（如出現(xiàn)行走、梳理毛發(fā)等情況），則使用相同的刺激力進行重復刺激。于術(shù)前、術(shù)后3、5、7、14 d 每組隨機抽取6 只大鼠進行痛閾測定，該操作由同一位實驗員進行，但其對動物分組情況不明。

1.3 免疫組化檢測各組大鼠中TRPV1 蛋白的表達在14 d 完成痛閾測定后，每組隨機抽取6 只大鼠麻醉后予4%多聚甲醛灌注組織，提取腰膨大段脊髓置于4%多聚甲醛中固定，制成石蠟切片。嚴格按照SP 法免疫組化試劑盒（南京凱基）說明檢測大鼠脊髓中TRPV1 蛋白的表達。每張免疫組化切片隨機拍攝3 張以上照片，對采集的圖片使用Image-pro Plus 6.0 軟件進行分析。

1.4 免疫印跡檢測各組大鼠中TRPV1 蛋白的表達在14 d 完成痛閾測定后，每組隨機抽取6 只大鼠，斷頭處死后，取腰膨大段脊髓，凍存于-80 ℃冰箱。提取腰膨大段脊髓背角組織的總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)模、孵育一抗（抗體稀釋度為1∶500，兔多克隆抗體，Invitrogen，美國）和二抗后，按ECL 試劑盒說明進行化學發(fā)光、顯影、定影。用image-J 軟件圖像分析系統(tǒng)對各條帶進行灰度測定，目標條帶TRPV1 與內(nèi)參β-actin 比較，以矯正蛋白定量、上樣過程中存在的實驗誤差。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)± 標準差表示，組內(nèi)、組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PGB 可減低CCI 模型大鼠機械痛閾為研究PGB 的鎮(zhèn)痛機制，首先構(gòu)建了CCI 大鼠模型，隨后予PGB、CPZ 治療以了解PGB 對CCI 模型大鼠機械痛閾的療效。研究結(jié)果表明：各組大鼠CCI 造模術(shù)前痛閾差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Sham 組大鼠術(shù)前術(shù)后各時間點痛閾比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；CCI 組、CCI+PGB 組、CCI+CPZ 組、CCI + CPZ + PGB 組大鼠術(shù)后各時間點痛閾低于術(shù)前（P＜0.05）。術(shù)后14 d，CCI 組（3.78±1.80）g、CCI + PGB 組（5.56 ± 1.62）g、CCI + CPZ 組（7.67 ±1.57）g、CCI+CPZ+PGB組（8.00±1.37）g 大鼠痛閾低 于Sham 組（18.72 ± 6.17）g（P＜0.05）；CCI +PGB組、CCI+CPZ組、CCI+CPZ+PGB組大鼠痛閾高于CCI 組（P＜0.05）；CCI + CPZ + PGB 組、CCI+CPZ組大鼠痛閾高于CCI+PGB組（P＜0.05）；CCI +CPZ + PGB 組大鼠痛閾高于CCI + CPZ 組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組大鼠造模術(shù)前后痛閾變化詳見圖1。

圖1 PGB 可減低CCI 模型大鼠機械痛閾Fig.1 PGB reduces mechanical pain threshold in CCI model rats

各組大鼠CCI 造模術(shù)前、術(shù)后3 d、術(shù)后5 d、術(shù)后7 d 及術(shù)后14 d 的機械痛閾比較顯示：各組大鼠術(shù)前痛閾差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Sham 組大鼠術(shù)前后各時間點痛閾比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；CCI 組、CCI + PGB 組、CCI + CPZ 組、CCI+CPZ+PGB 組大鼠術(shù)后各時間點痛閾低于術(shù)前（P＜0.05）；術(shù)后各時間點CCI 組、CCI+PGB 組、CCI + CPZ 組、CCI + CPZ + PGB 組大鼠痛閾低于sham 組（P＜0.05）；術(shù)后14 d，CCI + PGB 組、CCI +CPZ 組、CCI + CPZ + PGB 組大鼠痛閾高于CCI 組（P＜0.05）；CCI+CPZ+PGB 組、CCI+CPZ 組大鼠痛閾高于CCI+PGB 組（P＜0.05）。

2.2 PGB 可減低CCI 模型大鼠TRPV1 蛋白的表達既往研究表明電壓門控鈣離子通道激活蛋白TRPV1 的激活會引起疼痛反應(yīng)增強，其在多種炎性和神經(jīng)病理性疼痛模型中表達上調(diào)，抑制TRPV1 時疼痛減輕；而PGB 可作用于CNS 中電壓門控鈣離子通道（VGCC）的α2δ亞基蛋白。因此，為探討PGB 提高CCI 模型大鼠機械痛閾的機制，我們檢測了各組大鼠中TRPV1 蛋白的表達。免疫組化研究結(jié)果顯示（圖3、4）：造模術(shù)后14 d，CCI 組（光密度值為0.177 6 ± 0.004 2）、CCI +PGB 組（0.160 3 ± 0.005 6）、CCI + CPZ 組（0.143 3± 0.004 1）、CCI + CPZ + PGB 組（0.140 4 ± 0.005 6）大鼠的TRPV1 蛋白表達高于Sham 組（0.124 8 ±0.008 5）大鼠（P＜0.05）；但經(jīng)治療后，CCI + PGB組、CCI + CPZ 組、CCI + CPZ + PGB 組大鼠TRPV1蛋白的表達比CCI 組低（P＜0.05），CCI + CPZ 組、CCI + CPZ + PGB 組大鼠TRPV1 蛋白的表達比CCI + PGB 組低（P＜0.05）；CCI + CPZ + PGB 組與CCI + CPZ 組大鼠的TRPV1 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

類似的，免疫印跡結(jié)果也顯示（圖4）：造模術(shù)后14 d，Sham 組、CCI 組、CCI+PGB 組、CCI+CPZ 組、CCI + CPZ + PGB 組大鼠脊髓的TRPV1 的蛋白表達分別為0.124 8 ± 0.008 5、0.177 6 ± 0.004 2、0.160 3±0.005 6、0.143 3±0.004 1、0.140 4±0.005 6。CCI 組、CCI + PGB 組、CCI + CPZ 組、CCI + CPZ +PGB 組大鼠脊髓的TRPV1 的蛋白表達比sham 組大鼠明顯升高（P＜0.05）；CCI+PGB 組、CCI+CPZ組、CCI + CPZ + PGB 組大鼠的TRPV1 蛋白表達比CCI 組低（P＜0.05）；CCI+CPZ 組TRPV1 蛋白表達比CCI + PGB 組低（P＜0.05）；CCI + CPZ 組（0.93 ±0.02）大鼠TRPV1 蛋白表達與CCI +CPZ+PGB 組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。因此，以上免疫組化和免疫印跡結(jié)果充分表明PGB 可減低CCI模型大鼠TRPV1 蛋白的表達。

圖2 免疫組化檢測各組大鼠術(shù)后14 d 脊髓TRPV1 蛋白的表達情況Fig.2 Immunohistochemical detection of TRPV1 protein expression in the spinal cord of rats in each group at 14 days after surgery

圖3 免疫組化檢測各組大鼠術(shù)后14 d 脊髓TRPV1 蛋白的表達的定量分析Fig.3 Quantitative analysis of the expression of TRPV1 protein in the spinal cord of rats in each group at 14 days after immunohistochemical detection

各組大鼠免疫組化染色TRPV1 蛋白后光密度定量分析結(jié)果顯示：造模術(shù)后14 d，CCI 組、CCI +PGB 組、CCI + CPZ 組、CCI + CPZ + PGB 組大鼠的TRPV1 蛋白表達高于Sham 組（P＜0.05）；但經(jīng)治療后，CCI + PGB 組、CCI + CPZ 組、CCI + CPZ + PGB組大鼠TRPV1 蛋白的表達比CCI 組低（P＜0.05），CCI + CPZ 組、CCI + CPZ + PGB 組大鼠TRPV1 蛋白的表達比CCI+PGB組低（P＜0.05）。

免疫印跡結(jié)果顯示：造模術(shù)后14 d，CCI 組、CCI+PGB 組、CCI+CPZ 組、CCI+CPZ+PGB 組大鼠脊髓的TRPV1 的蛋白表達比Sham組大鼠明顯升高（P＜0.05）；CCI + PGB 組、CCI + CPZ 組、CCI +CPZ + PGB 組大鼠的TRPV1 蛋白表達比CCI 組低（P＜0.05）；CCI + CPZ 組TRPV1 蛋白表達比CCI +PGB組低（P＜0.05）。

2.3 PGB可通過抑制TRPV1蛋白的表達而減輕神經(jīng)病理性疼痛為進一步研究PGB 的鎮(zhèn)痛機制，同樣構(gòu)建了CCI 大鼠模型，予PGB 治療CCI 大鼠后，再予TRPV1 激動劑辣椒素CP 干預(yù)。研究結(jié)果（圖4）表明：術(shù)后14 d，CCI 組（3.60 ± 1.14）g、CCI+PGB 組（8.40±1.14）g 大鼠痛閾低于Sham 組（18.00 ± 1.58）g（P＜0.05）；予PGB 治療CCI 大鼠后，CCI + PGB 組大鼠痛閾比CCI 組升高了（P＜0.05）；同時給予PGB 和TRPV1 激動劑辣椒素CP干預(yù)CCI 大鼠后，CCI + PGB + CP 組（4.2 ± 1.30）g痛閾低于CCI+PGB 組（P＜0.05），且與CCI 組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這些結(jié)果表明PGB 可通過抑制TRPV1 蛋白的表達而減輕神經(jīng)病理性疼痛。

圖4 免疫印跡檢測各組大鼠術(shù)后14 d 脊髓TRPV1 蛋白的表達Fig.4 TRPV1 protein expression in the spinal cord of rats in each group at 14 days after immunoblot detection

圖4 PGB 通過抑制TRPV1 蛋白的表達而提高CCI 模型大鼠機械痛閾Fig.4 PGB increases the mechanical pain threshold of CCI model rats by inhibiting the expression of TRPV1 protein

術(shù)后14 d CCI 組、CCI + PGB 組、CCI + PGB +CP 組大鼠痛閾均低于Sham 組（P＜0.05）。術(shù)后14 d，CCI+PGB 組大鼠痛閾高于CCI組（P＜0.05），CCI + PGB + CP 組大鼠痛閾與CCI 組大鼠痛閾差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），小于CCI+PGB組大鼠（P＜0.05）。

3 討論

疼痛是與實際或者潛在的組織損傷相關(guān)的令人不愉快的情感體驗［1］，在一定程度上疼痛是一種自我保護機制［1，9］，但NP 疼痛可持續(xù)較長時間，甚至數(shù)月乃至數(shù)年［5］。慢性疼痛性疾病包括NP、脊柱源性疼痛、癌性疼痛、炎性相關(guān)性疼痛等［3］。據(jù)調(diào)查研究，中國北京慢性疼痛在社區(qū)的患病率為8.91%［10-11］。此外，慢性疼痛性疾病常常與代謝性疾病、精神性疾?。òń箲]和抑郁）等相伴隨［4，12］?？傊?，慢性疼痛對患者的精神、經(jīng)濟、身體健康產(chǎn)生較大影響，是一種較為普遍公共衛(wèi)生問題。因此，探討慢性疼痛特別是NP 的治療方法及其機制具有重要的意義。

本研究中，為研究NP 的機制，首先構(gòu)建了CCI大鼠模型，隨后予PGB 或TRPV1 抑制劑CPZ 治療以了解他們對CCI 模型大鼠機械痛閾的療效。研究結(jié)果表明PGB 和CPZ 都能有效地提高CCI 大鼠模型的痛閾。為進一步研究PGB 的鎮(zhèn)痛機制，檢測了與疼痛正相關(guān)的電壓門控鈣離子通道激活蛋白TRPV1 在CCI 大鼠脊髓中的表達，免疫組化和免疫印跡結(jié)果均充分表明PGB 可減低CCI 模型大鼠脊髓中TRPV1 蛋白的表達；同時給予PGB 和TRPV1 激動劑CP 干預(yù)CCI 大鼠后，其痛閾比CCI+PGB 組大鼠降低了，且與CCI 組大鼠比較差異無統(tǒng)計學意義。這表明PGB 可通過下調(diào)脊髓中TRPV1 蛋白的表達來對神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。

PGB 是一種抗癲癇藥物，是目前治療NP 的一線用藥［8］。孫卓浩等［9］通過對1 625 例PHN 患者的研究表明，經(jīng)PGB 治療后患者睡眠干擾指數(shù)減少，VAS、NRS 評分均降低。PGB 可減少谷氨酸為主的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放，從而抑制神經(jīng)元的過度興奮以達到鎮(zhèn)痛的目的［10］。但PGB治療NP的作用機制目前尚未被完全闡明。本研究中，為研究PGB 的鎮(zhèn)痛機制，首先構(gòu)建了常用的神經(jīng)病理性疼痛模型——CCI 大鼠模型，隨后予PGB 治療，結(jié)果顯示PGB 可有效地提高CCI 大鼠模型的痛閾。

TRPV1 又稱辣椒素受體，是一種非選擇性陽離子通道，其主要作用于周圍神經(jīng)系統(tǒng)傷害性感受神經(jīng)元中。TRPV1 可通過細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑，進而激活酪氨酸激酶受體（RTKs）和G 蛋白耦聯(lián)受體（GPCRs）而致敏。TRPV1 也可被內(nèi)源性的配體，酸性環(huán)境、高于42 ℃的溫度等外源性所激活，進而激活電壓門控鈣離子通道，引發(fā)一系列的生物學效應(yīng)。TRPV1 的致敏與激活均可增強疼痛反應(yīng)。在多種疼痛模型中TRPV1 表達上調(diào)，疼痛減輕［13-15］，表明TRPV1 是疼痛信號傳導的關(guān)鍵整合者。大鼠坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷（chronic constriction injury，CCI）模型是神經(jīng)病理性疼痛常用模型［16-17］。研究［18-20］表明在CCI 模型中，脊髓里的TRPV1 會上調(diào)。辣椒素（capsaicin，CAP）是TRPV1 的激動劑，其可誘導CCI 模型脊髓中的P 物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽等神經(jīng)肽的釋放增加而導致TRPV1 致敏，進而參與到神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和（或）維持［20］。因此為進一步研究PGB 的鎮(zhèn)痛機制，本文檢測了與疼痛正相關(guān)的蛋白TRPV1在CCI 大鼠脊髓中的表達，免疫組化和免疫印跡結(jié)果均充分表明PGB 可減低CCI 模型大鼠脊髓中TRPV1 蛋白的表達。此外本研究結(jié)果還顯示TRPV1 抑制劑CPZ 組對CCI 鼠的鎮(zhèn)痛作用強于PGB，CCI + CPZ 組TRPV1 蛋白表達比CCI + PGB組低（P＜0.05），CCI + CPZ 組大鼠TRPV1 蛋白表達與CCI + CPZ + PGB 組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。即抑制TRPV1 蛋白的表達后，PGB 不能通過進一步抑制TRPV1 的表達以提高機械痛閾。同時給予PGB 和TRPV1 激動劑CP 干預(yù)CCI大鼠后，CCI + PGB + CP 組大鼠的痛閾比CCI +PGB 組大鼠降低了，且與CCI 組大鼠比較差異無統(tǒng)計學意義。這些結(jié)果表明PGB 可通過下調(diào)脊髓中TRPV1 蛋白的表達，從而緩解神經(jīng)病理性疼痛。

綜上所述，NP 是一種較為普遍公共衛(wèi)生問題，探討NP 的治療方法及其機制具有重要的意義。本研究中，為研究NP 的機制，首先構(gòu)建了常用的神經(jīng)病理性疼痛模型——CCI 大鼠模型，隨后予PGB 或TRPV1 抑制劑CPZ 治療，結(jié)果表明PGB和CPZ 都能有效地提高CCI 大鼠模型的痛閾。為進一步研究PGB 的鎮(zhèn)痛機制，檢測了與疼痛正相關(guān)的TRPV1 蛋白在CCI 大鼠脊髓中的表達，免疫組化和免疫印跡結(jié)果都顯示PGB 可減低CCI 模型大鼠脊髓中TRPV1 蛋白的表達；同時給予PGB 和TRPV1 激動劑CP 干預(yù)CCI 大鼠后，其痛閾比CCI+PGB 組大鼠降低了，且與CCI 組大鼠比較差異無統(tǒng)計學意義。這表明PGB 可通過抑制TRPV1 蛋白表達來緩解神經(jīng)病理性疼痛。這為NP 的治療提供了新的思路。

NP 是一種較為普遍公共衛(wèi)生問題，探討NP的治療方法及其機制具有重要的意義。本研究結(jié)果表明PGB 可通過抑制TRPV1 蛋白表達來緩解神經(jīng)病理性疼痛，但仍需在體內(nèi)外實驗、甚至人體實驗中進一步驗證，同時TRPV1 蛋白的上下游靶點的作用也仍需進一步探討。