黃發(fā) 呂嘉賢 許靜紅 姚紀(jì)友 童荔 胡曉光 朱艷平曹璐 蔡常潔

1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院（廣州510080）；2廣東省器官捐獻(xiàn)與移植免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省器官移植科技合作基地（廣州510080）；3廣州市第一人民醫(yī)院（廣州510000）

膿毒癥是由感染導(dǎo)致的宿主反應(yīng)失調(diào)的威脅生命器官功能障礙［1］。即使在重癥監(jiān)護(hù)室中得到及時的救治，膿毒癥休克引起的病死率仍可達(dá)30%～44.3%［2］。目前，越來越多證據(jù)顯示，膿毒癥患者即使存活，后期仍會出現(xiàn)其他新發(fā)的臨床癥狀，遠(yuǎn)期的致殘效果［3］和逐漸惡化的慢性疾?。?］。

目前對于膿毒癥的診斷，主要依靠臨床表現(xiàn)，但特異性較低，相對滯后［1］。外泌體是一種發(fā)源于細(xì)胞內(nèi)吞系統(tǒng)中的晚期內(nèi)體，可由各種類型的細(xì)胞分泌，并形成多形性囊泡樣小體，直徑大多介于40 ～150 nm 之間［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)外泌體中包含大量的蛋白質(zhì)和RNA，后者包括mRNA、miRNA 和非編碼RNA。這種納米級被膜結(jié)構(gòu)能夠參與細(xì)胞間的物質(zhì)交換和信息交流，在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用［7-8］。同時，外泌體除了能穩(wěn)定的存在血漿中，還能相對穩(wěn)定地存在于各種液體中，包括唾液、母乳、腦脊液、腹水等，可以實(shí)現(xiàn)快速、無創(chuàng)檢測［9］。通過實(shí)時動態(tài)監(jiān)控外泌體的變化，能夠及時有效地輔助確診膿毒癥患者特定的病原體以及判斷目前治療方案是否有效［5］。

目前關(guān)于外泌體miRNA 在膿毒癥中的表達(dá)情況、作用及其機(jī)制的研究仍處于起步階段［10-12］。在本研究的前期，本研究通過膿毒癥患者血漿芯片法發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血漿中miR-519c-5p 表達(dá)上調(diào)［13］。為進(jìn)一步研究外泌體中miR-519c-5p 的升高對膿毒癥的作用影響及其機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過上調(diào)外泌體中miR-519c-5p 表達(dá)，驗(yàn)證了外泌體介導(dǎo)的miR-519c-5p 是能促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而在一定程度上預(yù)測膿毒癥的病情進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器超速離心機(jī)（Beckman Coulter Optima-XE 100，美國），納米顆粒跟蹤分析儀（Malvern，Nanosight NS 3000，英國），透射電鏡（Hitachi，日本），二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific Forma，美國），熒光顯微鏡（Leica DMI8，德國），光學(xué)顯微鏡（Leica，德國），激光共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM 710，德國），超純水系統(tǒng)（Merck Millipore，德國），450 型自動酶標(biāo)儀系統(tǒng)（SunriseTM，瑞士），流式細(xì)胞儀（CytoFLEX，美國）。

1.1.2 主要試劑脂多糖（Sigma，美國），Cell Counting Kit-8（Dojindo，日本），Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（Solarbio，中國），蛋白抗體（Abcam，英國），has-miR-519c-5p 及u6 q RT-PCR 引物、陰性對照（negativecontrol，NC）、MicrONTMCy3-hasmiR-519c-5p 模擬物（mimic）及其NC 為銳博公司產(chǎn)品，miRNeasy Mini Kit（QIAGEN，中國），SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa），cDNA 試劑盒（Thermo Scientific，美國），TRIzolTMRegent（Thermo Scientific，美國），Dr.GenTLETMPrecipitation Carrier（Takara#9094，日本），PKH 67（Sigma，美國），DAPI（鼎國，中國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購 于 美 國ScienCell 研究室。HUVECs 細(xì)胞株培養(yǎng)液為ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+5%胎牛血清（4 ℃，超速120 000 ×g離心18 h 去除胎牛血清中外泌體）+1%青鏈霉素+1%生長因子，5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 ～3 d 傳代1 次。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。種板時取對數(shù)生長期的HUVECs 細(xì)胞，0.25%胰酶制成單個細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為1 × 105/mL，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求鋪于6 孔板（每孔2 mL）或96 孔板（每孔100 μL），培養(yǎng)24 h 待其貼壁后饑餓處理再行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組細(xì)胞接種于6 孔板或96 孔板24 h 后經(jīng)饑餓處理后，分為空白組：HUVECs +blank-exosomes 組；對照組：HUVECs+ LPS +blankexosomes組，HUVECs+miR-519c-5p-exosomes組；實(shí)驗(yàn)組：HUVECs+ LPS + miR-519c-5p-exosomes 組。對于需要LPS 刺激的細(xì)胞：加入終濃度為10 μg/mL的LPS或者等量的PBS共同孵育6 h終止后換液［14］，對于需要外泌體刺激的細(xì)胞：加入2 μg 經(jīng)BCA 測定濃度的外泌體或者等量體積的PBS 與細(xì)胞濃度為1×105/mL 共同孵育12 h［15］。

1.4 外泌體

1.4.1 外泌體收集取培養(yǎng)48 ～72 h 的HUVECs，收集培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，收集完畢后將培養(yǎng)瓶中的HUVECs 繼續(xù)培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代。將收集好的的培養(yǎng)基放入離心管中，4 ℃2 000 ×g離心30 min以去除培養(yǎng)基中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片等。將離心好的不含細(xì)胞和碎片的培養(yǎng)基移入超速離心管，并放入超速離心機(jī)中，注意不要碰到原離心管底部的離心沉淀物，以4 ℃，高速16 800 ×g離心30 min以去除微小顆粒，將予以離心好的培養(yǎng)基予以0.22 μm 濾膜過濾。過濾完后放置移入新的超速離心管，放入超速離心機(jī)中，以4 ℃，超速100 000 ～120 000×g離心70 min，去除上清，注意不要把底部沉淀吸走。超速離心管中加入適量PBS 充分混勻溶解沉淀后重復(fù)4 ℃，超速100 000 ～120 000×g離心70 min，最后予以50～100 μL PBS 吹打離心管底部的外泌體，使其充分溶解溶解沉淀的外泌體。4 ℃保存?zhèn)溆?。長期保存時置于-80 ℃［16］。

1.4.2 外泌體形態(tài)鑒定取出在-80 ℃冰箱保存的外泌體，放置于冰水混合物中解凍。取濃度為0.5 mg/mL的外泌體10 μL滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去浮液。然后醋酸雙氧鈾負(fù)染1 min，濾紙吸掉多余液體。常溫干燥15 min，上機(jī)，80～120 kV 成像。

1.4.3 外泌體粒徑鑒定使用Nanosight NS3000 測量樣品粒徑前，先予以超純水緩慢推注，清洗檢測管路及測試板，并將管路及測試板中的氣泡予以去除。將濃度為0.5 mg/mL 的外泌體樣品1∶1 000稀釋于標(biāo)準(zhǔn)PBS 中成1～2 mL，使用1 mL 注射器取1 mL 稀釋后的樣品緩慢注入檢測管路中，讓樣品勻速通過檢測管路。在軟件可見比較均勻的顆粒通過時，即可以實(shí)施檢測。NTA 軟件即開始紀(jì)錄每一個顆粒的布朗運(yùn)動，并對于每個顆粒自動定位，跟蹤其中心運(yùn)動的軌跡，計(jì)算平均唯一，繪制出顆粒散射光強(qiáng)-粒徑-數(shù)量分布的三維圖，NTA 軟件可計(jì)算出顆粒粒徑的數(shù)量分布信息。

1.4.4 Western Blot取出在-80 ℃冰箱保存的外泌體，并采用BCA 法測量外泌體濃度，取20 μg 外泌體樣品+等體積SDS samplebuffer，煮沸5 min。根據(jù)待測蛋白分子量的大?。–D63 預(yù)測分子量大小26 kDa，TSG101 預(yù)測分子量大小44 kDa）選擇合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF 膜電轉(zhuǎn)，封閉完孵育一抗4 ℃過夜，根據(jù)說明書推薦配制一抗?jié)舛龋篊D63（1∶1 000）、TSG101（1∶1 000）；PBST洗膜后孵育二抗1 h，再洗膜。ECL 化學(xué)發(fā)光液顯色后于化學(xué)發(fā)光成像儀器中曝光。

1.4.5 外泌體轉(zhuǎn)染超速離心后所得外泌體沉淀，予以50～100 μL PBS 重懸后，BCA 法測量外泌體蛋白濃度，將200 pmol miR-519c-5pmimic 或者mimicNC 與20 μg 外泌體在無菌PBS 中混合，然后加入CaCl2（終濃度0.1 mol/L）。使用無菌PBS 將最終體積調(diào)節(jié)至300 μL。將混合物再置于冰上5 min。最后再次4 ℃，超速120 000×g離心70 min 分離外泌體［17］。

1.4.6 細(xì)胞攝取外泌體實(shí)驗(yàn)超速離心后所得的外泌體沉淀，重懸于0.5 mL Diluent C 中，同時將4 μL PKH 67 添加至0.5 mL Diluent C 中，兩者混勻，常溫避光孵育4 min。隨后添加2 mL 0.5%BSA 以終止過度染色，將標(biāo)記的外泌體再次超速離心1 h 以清楚殘余燃料，隨后外泌體沉淀重懸于200 μL PBS 中。將標(biāo)記好后的外泌體添加到受體細(xì)胞中（共聚焦培養(yǎng)皿，20 μg/mL），37 ℃孵育8 h。吸去細(xì)胞上清夜，用PBS 洗1 次，加入固定液，避光孵育10 min，吸去固定液，用PBS 洗2 次，每次2 min，手搖或者搖床震蕩。加入1 mL DAPI（染細(xì)胞核），避光孵育5 min。吸去DAPI，用PBS 洗3次，每次2 min，手搖或者搖床震蕩。最后在共聚焦皿中加入1 mL PBS，避光保存，立即予以上共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取外泌體熒光顯色情況。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR 法使用Trizol 提取細(xì)胞與外泌體總RNA，在提取外泌體總RNA 時，需加入Takara#9094 助沉劑，后按照說明書進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 法，后續(xù)PCR 條件為95 ℃30 s；40 個PCR循環(huán)（95 ℃5 s；60 ℃30 s），反應(yīng)總體積20 μL。以u6 作為內(nèi)參。引物序列如下示：

miR-519c-5p（Forward Primer（5′-3′）GTCACCGGGTGTAAATCAG）、（Reverse Primer（5′-3′）GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCAAG）；u6（Forward Primer（5′-3′）CTCGCTTCGGCAGCACA）、（Reverse Primer（5′-3′）AACGCTTCACGAATTTGCGT）。

1.6 CCK-8 法檢測各實(shí)驗(yàn)組HUVECs 的活力96 孔板中每孔加入CCK-8 10 μL，孵育1 h 后在酶標(biāo)儀450 nm 波長下檢測各孔吸光度，以O(shè)D值反映細(xì)胞增殖情況。

1.7 Annexin V-FITC/PI 雙染檢測各實(shí)驗(yàn)組HUVECs的凋亡率使用0.25%不含EDTA 的胰酶消化6 孔板內(nèi)的HUVECs，室溫下1 000 r/min 離心5 min，棄上清液。將細(xì)胞沉淀重懸在1 mL bindingbuffer 中，37 ℃孵育10 min，室溫下1 000 r/min 離心5 min，去上清。將細(xì)胞重懸在100 μL bindingbuffer 中，按照說明書加入適量染色劑Annexin V/PI，室溫避光孵育15 min 后加入400 μL bindingbuffer，于1 h 內(nèi)上機(jī)檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理。兩組數(shù)據(jù)間比較，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差其的數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)；呈正態(tài)分布但方差不齊的數(shù)據(jù)采用校正t檢驗(yàn)。多組件比較數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，組間比較分析采用Dunnettt 檢驗(yàn)。其中P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體粒徑分布在（158.9 ± 36.4）nm 左右并表達(dá)CD63、TSG101收集細(xì)胞培養(yǎng)基，利用超速離心法提取外泌體，透射電鏡鑒定所得外泌體形態(tài)（圖1A）。透射電鏡鑒定外泌體形態(tài)上均呈現(xiàn)雙層膜茶托樣結(jié)構(gòu)。Nanosight NS3000 結(jié)果表明收集得外泌體粒徑分布集中于（158.9±36.4）nm 左右（圖1B），顆粒濃度在107/mL，具體產(chǎn)量隨細(xì)胞狀態(tài)，培養(yǎng)時間及純化分析方式不同有較大波動。同時，Western Blot 顯示收集得外泌體均表達(dá)常見外泌體標(biāo)記蛋白CD63、TSG101（圖1C）。

圖1 外泌體鑒定Fig.1 The identification of exosomes

2.2 轉(zhuǎn)染組外泌體miR-519c-5p 以及攝取外泌體的內(nèi)皮細(xì)胞的miR-519c-5p 表達(dá)量升高qRTPCR 結(jié)果（圖2）顯示：空白組的外泌體幾乎不表達(dá)miR-519c-5p，而轉(zhuǎn)染miR-519c-5p mimic 的外泌體組能穩(wěn)定高表達(dá)miR-519c-5p（P＜0.001）；同時，穩(wěn)定高表達(dá)miR-519c-5p 的外泌體與各組HUVECs共培養(yǎng)后，同樣均高表達(dá)miR-519c-5p（P＜0.001）。

圖2 轉(zhuǎn)染后的外泌體和與轉(zhuǎn)染后的外泌體共培養(yǎng)的細(xì)胞過表達(dá)miR-519c-5pFig.2 MiR-519c-5p was overexpressed in transfected exosomes and in the cells co-cultured with the transfected exosomes

2.3 HUVECs 攝取過表達(dá)miR-519c-5p 的外泌體激光共聚焦結(jié)果顯示（圖3）HUVECs 中既有綠色熒光標(biāo)記的外泌體，又有紅色熒光標(biāo)記的miR-519c-5p，兩者重疊的時候?yàn)辄S色，這直觀的表明外泌體可將miR-519c-5p 運(yùn)送至HUVECs 中。

2.4 過表達(dá)miR-519c-5p 的外泌體能夠抑制HUVECs 增殖空白組培養(yǎng)12 h 后平均OD值為（1.388±0.03）；對照組在培養(yǎng)12 h 后平均OD值為（0.843±0.04）；實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)12 h 后平均OD值為（0.458 ± 0.01）；可見實(shí)驗(yàn)組OD值最低（0.458vs.0.843，P=0.048；0.458vs.1.388，P＜0.001），對照組OD值同時亦低于空白組（0.843vs.1.388，P=0.048），見圖4。

2.5 過表達(dá)miR-519c-5p 外泌體增加HUVECs 凋亡空白組平均凋亡率（0.647 ± 0.04）%，對照組HUVECs + LPS + blank-exosomes 平均凋亡率為（3.517 ± 0.61）%，對照組HUVECs + miR-519c-5pexosomes的平均凋亡率為（3.33±0.135）%，對照組間平均凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（3.517%vs.3.33%，P= 0.104），兩組對照組平均凋亡率為（3.423 ±0.75）%，實(shí)驗(yàn)組平均凋亡率為（7.197 ± 0.16）%。實(shí)驗(yàn)組HUVECs 平均凋亡率比空白組、對照組的高（7.197%vs.0.647%，P＜0.001；7.197%vs.3.423%，P= 0.001），空白組HUVECs 凋亡率比對照組的低（0.647%vs.3.423%，P=0.001），實(shí)驗(yàn)組的HUVECs的平均凋亡率最高，見圖5。

3 討論

膿毒癥一直是重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。如果膿毒癥患者不能得到及時和有效的救治，將會引起多器官的功能損傷，短期時間內(nèi)發(fā)展成多器官功能衰竭，最后死亡。 有研究表明，膿毒癥的根本原因是機(jī)體對外部損傷的過度反應(yīng)障礙，這是膿毒癥導(dǎo)致遠(yuǎn)處器官損傷的根本原因［18］。因此，揭示膿毒癥的形成機(jī)制，做到盡早預(yù)警膿毒是非常重要的。目前為止，膿毒癥治療指南已經(jīng)更新至第三版，但仍未尋找到能直接監(jiān)測由膿毒癥引起的組織損傷或者能預(yù)測隨后發(fā)生的臟器功能衰竭分子生物學(xué)標(biāo)志物［1，19-20］。目前的膿毒癥標(biāo)志物，如乳酸和降鈣素原也許能夠明確是否出現(xiàn)組織灌注不足或者發(fā)生臟器功能衰竭，但并不能很好地運(yùn)用于抗生素的調(diào)整使用［21］。早期的研究表明膿毒癥當(dāng)中miRNA 具有促進(jìn)炎癥或免疫反應(yīng)的作用［22］，像miR-26a-5p、miR-339-5p 能夠抑制核內(nèi)κB 因子的表達(dá)［23-24］，miR-185-5p 能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖和分化［25］。miRNA 在常態(tài)下極易分解，但在人體血漿中，miRNA 經(jīng)常通過以下途徑來保持其穩(wěn)定：（1）與高密度脂蛋白結(jié)合；（2）與argonaute 蛋白結(jié)合；（3）裝載入保護(hù)性囊泡如外泌體［26］。在近十年的研究中，發(fā)現(xiàn)外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間交流信息的重要作用，并且對于腫瘤微環(huán)境的形成以及腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸起著重要的幫兇作用［27］。外泌體的釋放代表一種即時的細(xì)胞通訊機(jī)制，可以實(shí)現(xiàn)3 個主要功能：（1）將表達(dá)模式轉(zhuǎn)移至其他細(xì)胞；（2）在液相內(nèi)分散膜結(jié)合介體；（3）以及細(xì)胞表明快速重排［5］。外泌體可立即以旁分泌方式修飾鄰近的細(xì)胞表型，但也可以通過將膜成分和（或）表達(dá)方式轉(zhuǎn)移至循環(huán)的其他區(qū)域。目前有文獻(xiàn)表明，外泌體監(jiān)測能有效的幫助鑒定和表征給膿毒癥患者特定的病理生理學(xué)，以及評估患者可用的各種治療方案的功效。同時，外泌體也是理想的載藥系統(tǒng)，通過外泌體介導(dǎo)的藥物能夠有效的傳送至靶點(diǎn)啟動治療效果［28］。

圖3 激光共聚焦鏡下血管內(nèi)皮細(xì)胞Fig.3 HUVECs in laser confocus microscope

圖4 不同分組的HUVECs 增值活性檢測結(jié)果Fig.4 Proliferative activity in different groups of HUVECs

圖5 不同分組HUVECs 凋亡檢測流式結(jié)果以及結(jié)果定量分析圖Fig.5 Flow cytometry resultsand quantitative analysis of apoptosis detection in different groups

本研究中，通過LPS 誘導(dǎo)HUVECs 構(gòu)建膿毒癥細(xì)胞模型，將通過轉(zhuǎn)染miR-519c-5pmimic 得到過表達(dá)miR-519c-5p 的外泌體與之共培養(yǎng)，共培養(yǎng)后的HUVECs 的通過CCK8 法與流式細(xì)胞術(shù)檢測其增殖能力與凋亡情況。結(jié)果顯示過表達(dá)的miR-519c-5p 外泌體能夠促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的HUVECs 增殖能力下降，凋亡增多。目前對于外泌體高表達(dá)miR-519c-5p 能促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的HUVECs 凋亡的機(jī)制并不清楚，并且對于miR-519c-5p 在膿毒癥中發(fā)揮的作用也不清楚。目前研究表明miR-519c 家族可能與RNA 結(jié)合蛋白HuR 有關(guān)［29］。miR-519 靶向結(jié)合HuR mRNA 并抑制其翻譯，顯示了一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子（miRNA）對另一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子（RNA 結(jié)合蛋白）的調(diào)節(jié)作用。與大多數(shù)miRNA與目標(biāo)mRNA 的3′-UTR 相互作用不同，miR-519 似乎主要通過與HuRmRNA 的編碼區(qū)（CR）結(jié)合起作用。RNA 結(jié)合蛋白（RBPs）是哺乳動物細(xì)胞中基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。它們影響基因表達(dá)的關(guān)鍵，包括mRNA 剪接、5′加帽、3′聚腺苷酸化、核轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸、儲存、翻譯和周轉(zhuǎn)［30］。而HuR 是影響細(xì)胞對應(yīng)激物、增殖信號、抗凋亡、免疫觸發(fā)和發(fā)育線索的細(xì)胞響應(yīng)的最突出的特異性RBPs［31］。HuR 的靶標(biāo)還包括編碼促進(jìn)增值和血管生存的蛋白質(zhì)mRNA，以及增強(qiáng)細(xì)胞逃避衰老，凋亡和免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)［32］。miR-519 能抑制HuR 表達(dá)，降低HuR 翻譯，同時通過減少HuR 蛋白水平間接降低HuR 靶向mRNA，而這些mRNA 大多編碼增值蛋白，如細(xì)胞周期蛋白，生長因子（IGF-1R VEGF、EGF、TGF-β等），促有絲分裂和轉(zhuǎn)錄因子（c-fos、cmyc、c-jun、p53 等）的表達(dá)［33］，從而使細(xì)胞凋亡增加。miR-519c-5p 在外泌體中的高表達(dá)在對細(xì)胞的確切機(jī)制以及對膿毒癥狀態(tài)下的細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制和進(jìn)展仍有待于進(jìn)一步的研究。

綜上所述，外泌體介導(dǎo)的miR-519c-5p 也許通過調(diào)節(jié)RNA 結(jié)合蛋白HuR 從而影響細(xì)胞的增殖與凋亡。前期的研究發(fā)現(xiàn)［13］，血漿中miR-519c-5p升高的膿毒癥與膿毒癥休克患者病死率增高存在正相關(guān)，可以通過收集患者的液體比如唾液，腹腔積液，進(jìn)行外泌體分離提純，并檢測miR 表達(dá)譜，如miR-519c-5p，最終輔助評估患者病情，指導(dǎo)臨床治療，攻克膿毒癥診治難關(guān)。