羅益鋒 易慧 黃鑫炎 譚衛(wèi)平 郭禹標(biāo) 謝燦茂

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，中山大學(xué)呼吸病研究所（廣州510080）

間質(zhì)性肺疾?。╥nterstitial lung disease，ILD）是一類主要累及肺間質(zhì)和肺泡腔，導(dǎo)致肺泡-毛細(xì)血管功能單位喪失的彌漫性肺疾病，患者往往表現(xiàn)為慢性咳嗽、活動(dòng)后呼吸困難及進(jìn)行性加重的低氧血癥，肺功能提示限制性通氣功能障礙伴彌散功能障礙，后期多數(shù)都可引起彌漫性肺纖維化，現(xiàn)有的各種治療手段效果欠佳，患者最終出現(xiàn)呼吸功能衰竭而死亡。臨床上如能找到抑制或逆轉(zhuǎn)肺纖維化的方法，將大大改善間質(zhì)性肺疾病患者的預(yù)后。

纖維化是一類富含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)在結(jié)締組織中過度積聚、異常交聯(lián)，從而影響組織器官正常結(jié)構(gòu)和功能的病理改變。當(dāng)組織器官局部出現(xiàn)原發(fā)炎癥損傷后，機(jī)體啟動(dòng)創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制，組織細(xì)胞、成纖維細(xì)胞再生增殖。如在此過程中出現(xiàn)成纖維細(xì)胞等過度增殖的情況，即可使細(xì)胞外基質(zhì)生成增多、過度積聚，最終發(fā)生纖維化［1-3］。因此，成纖維細(xì)胞的激活及過度增殖是纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)。

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一個(gè)多功能性的細(xì)胞因子，除了具有促炎癥、免疫調(diào)節(jié)作用外，許多研究顯示其還與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，動(dòng)脈硬化，組織器官纖維化的發(fā)生發(fā)展等密切相關(guān)［4-9］。筆者此前的研究發(fā)現(xiàn)MIF 可促進(jìn)人肺癌細(xì)胞H460 的增殖［5］，因此筆者假設(shè)MIF 也可促進(jìn)人肺成纖維細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生。近年來有研究報(bào)道，MIF 可以促進(jìn)肥大細(xì)胞介導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖、分化，從而加快硬皮病患者皮膚纖維化的進(jìn)程［10］；另有研究［11］顯示MIF 可促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3 細(xì)胞的增殖。但MIF 對(duì)人肺成纖維細(xì)胞增殖及遷移能力的影響如何，國(guó)際上尚未報(bào)道。

本研究用MIF 抑制慢病毒感染人肺成纖維細(xì)胞HFL1，構(gòu)建MIF 抑制細(xì)胞株，觀察敲低MIF 表達(dá)后對(duì)HFL1 增殖及遷移能力的影響，旨在明確MIF水平下調(diào)是否能抑制HFL1 的增殖及遷移能力，減輕肺纖維化的程度，從而為間質(zhì)性肺疾病患者的治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)所用的人肺成纖維細(xì)胞HFL1 購(gòu)自于廣州賽庫(kù)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑DMEM 培養(yǎng)基、改良1640 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)HyClone 公司；F12-K 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；Puromycin 購(gòu)于美國(guó)sigma公司；PLV.I 購(gòu)于美國(guó)SBI 公司；Polybrene 購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz 公司；PEI 購(gòu)于中國(guó)輝園苑科技有限公司；高純度總RNA 快速提取試劑盒購(gòu)于中國(guó)BIOTEKE 公司；CCK8 試劑購(gòu)于中國(guó)碧云天科技有限公司；PBS 粉劑購(gòu)于中國(guó)博士德公司；抗青霉素鏈霉素（雙抗）購(gòu)于中國(guó)TBD 公司；trypsin-EDTA 溶液購(gòu)于中國(guó)BIOSHARP 公司；絲裂霉素購(gòu)于美國(guó)Roche 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HFL1 細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的F12-K培養(yǎng)基，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔48 h 更換1 次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80% ～90%密度時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2 慢病毒包裝提前1 d鋪3×106/孔293TN細(xì)胞于10 cm 平皿；取9 μg PLV.I-MIF 質(zhì)粒，3 μg pCMV-VSV-G、3 μg pMDLgpRRE、3 μg pRSV-Rev，0.6 mL 無血清DMEM，混合質(zhì)粒，加入36 μL PEI試劑旋渦離心，室溫孵育15 ～20 min；將轉(zhuǎn)染試劑和混合物加到293TN 細(xì)胞6 h 換液；混合均勻后，放回37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，感染24、48 及72 h 收集上層液體，室溫下3 000 r/min 離心5 min；取病毒上清分裝到1.5 mL 的EP 管中，放到-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)胞感染感染前1 d HFL1 細(xì)胞鋪6 孔板鋪至80%左右；加入2 mL 病毒上清，2 μg Polybrene及1 mL F12-K 培養(yǎng)基；于37 ℃、5%CO2，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。感染48 h 后檢測(cè)病毒感染效率。

1.2.4 總RNA 提取-逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）鑒定MIF 抑制細(xì)胞株用高純度總RNA 快速提取試劑盒（離心柱型）提取細(xì)胞總RNA并檢測(cè)濃度和純度，并根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR 所用的引物由上海生工生物公司合成，以β-actin 作為內(nèi)參基因，相關(guān)引物序列如下：MIF 上游5′-ATCAGCCCGGACAGGGT-3′和下游5′-ACCGTTTATTTCTCCCCACCAG-3′；β-actin上游5′-TGGCACCAGCACAATGAA-3′ 和下游5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。PCR 體系：ddH2O 7.4 μL，SYBR 10 μL，cDNA 1 μL，引物1.6 μL。qPCR 反應(yīng)條件：94 ℃，1 min，40 循環(huán)（94 ℃，15 s；60 ℃20 s；72 ℃20 s）。

1.2.5 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞消化下來，將細(xì)胞懸液接種到96 孔板中，每孔5 000 個(gè)細(xì)胞，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)養(yǎng)4、24、48 和72 h。向每孔加入20 μL CCK8 溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h；用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的光密度。

1.2.6 Woundhealing法檢測(cè)細(xì)胞遷移先用marker筆在6 孔板背后均勻地劃?rùn)M線，大約每隔0.5 ～1 cm 一道，橫穿過孔。每孔至少3 條線。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化下來，制成濃度為1 × 106/mL的細(xì)胞懸液均勻接種于6 孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；細(xì)胞均勻鋪滿板底后，用絲裂霉素（4 μg/mL）處理2 h，抑制細(xì)胞分裂，用10 μL 槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 清洗；加入含絲裂霉素（4 μg/mL）的完全培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于劃痕后0、24 和30 h 取下室細(xì)胞進(jìn)行拍照；Image Pro-Plus 6.0 軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移距離。細(xì)胞遷移能力用遷移率表示，遷移率=（0 h 的劃痕寬度-其他時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度）/0 h 的劃痕寬度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 軟件分析，所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，P＜0.05 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MIF 慢病毒成功感染HFL1 細(xì)胞本研究應(yīng)用MIF 抑制慢病毒感染人肺成纖維細(xì)胞HFL1，感染48 h 后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞感染的效率。結(jié)果顯示，MIF 抑制慢病毒感染HFL1 細(xì)胞中熒光率達(dá)95%以上（圖1）。

2.2 HFL1-sh-MIF 抑制細(xì)胞株的qPCR 鑒定設(shè)計(jì)針對(duì)MIF 的3 個(gè)抑制靶點(diǎn)，構(gòu)建細(xì)胞株HFL1-sh-MIF-A、HFL1-sh-MIF-B 和HFL1-sh-MIF-C，以HFL1-sh-NC 為對(duì)照組，用qPCR 方法檢測(cè)MIF mRNA 的表達(dá)水平，篩選表達(dá)水平最低的細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行后續(xù)的研究。結(jié)果如表1 和圖2 顯示，與HFL1-sh-NC 相比，細(xì)胞株HFL1-sh-MIF-B 的MIF mRNA 表達(dá)水平顯著下降（P＜0.001），抑制效率最高。因此篩選出細(xì)胞株HFL1-sh-MIF-B 作為后續(xù)研究的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞株，命名為細(xì)胞株HFL1-sh-MIF。

2.3 敲低MIF 抑制HFL1 細(xì)胞增殖為了探討敲低MIF 對(duì)HFL1 細(xì)胞增殖的影響，用CCK8 檢測(cè)兩組細(xì)胞活力，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的OD值來反應(yīng)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果如表2、圖3所示。4 h時(shí)，兩組細(xì)胞的OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；24、48 和72 h 時(shí)，對(duì)照組HFL1-sh-NC 的OD值高于實(shí)驗(yàn)組HFL1-sh-MIF，提示HFL1-sh-MIF 細(xì)胞株的增殖能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 不同細(xì)胞株MIF mRNA 的表達(dá)水平Tab.1 Quantitative results of mif mRNA expression in the established cell lines

圖2 抑制不同靶點(diǎn)后MIF mRNA 的表達(dá)水平Fig.2 MIF mRNA expressionfollowing the inhibition of different targets

表2 不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖情況Tab.2 Proliferation of control group and experimental group at different time points ±s

表2 不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖情況Tab.2 Proliferation of control group and experimental group at different time points ±s

注：與對(duì)照組相比，**P ＜0.01

時(shí)間（h）4 24 48 72光密度值對(duì)照組（HFL1-sh-NC，n=3）0.083±0.001 0.187±0.002 0.166±0.001 0.196±0.001實(shí)驗(yàn)組（HFL1-sh-MIF，n=3）0.084±0.003 0.105±0.001**0.060±0.000**0.089±0.004**

2.4 敲低MIF 抑制HFL1 細(xì)胞遷移能力為了明確敲低MIF 對(duì)HFL1 細(xì)胞遷移能力的影響，用Woundhealing 法檢測(cè)對(duì)照組HFL1-sh-NC 及實(shí)驗(yàn)組HFL1-sh-MIF 細(xì)胞株的遷移能力，用遷移率反應(yīng)細(xì)胞的遷移能力。24 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組HFL1 細(xì)胞的遷移率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；30 h 時(shí)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HFL1-sh-MIF 遷移率顯著降低，提示實(shí)驗(yàn)組HFL1-sh-MIF 細(xì)胞株的遷移能力降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3、圖4。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移率Tab.3 Migration rate of controll group and experimental group at different time points ±s

表3 不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移率Tab.3 Migration rate of controll group and experimental group at different time points ±s

注：與對(duì)照組相比，##P ＜0.01

組別對(duì)照組（HFL1-sh-NC）實(shí)驗(yàn)組（HFL1-sh-MIF）0 h 0 0 24 h 0.522±0.041 0.507±0.027 30 h 0.810±0.023 0.595±0.045##

3 討論

MIF 做為一個(gè)多功能性的細(xì)胞因子，廣泛參與到人類炎癥、腫瘤、代謝、纖維化等各種疾病的發(fā)病機(jī)制中。自50 多年前MIF 被發(fā)現(xiàn)后，以其作為靶因子進(jìn)行了許多基礎(chǔ)及臨床醫(yī)學(xué)的相關(guān)研究。常用的針對(duì)MIF 進(jìn)行干預(yù)的手段包括使用抗MIF 抗體、MIF 拮抗劑ISO-1 及運(yùn)用RNA 干擾技術(shù)等［5，12-14］。構(gòu)建shRNA 的慢病毒表達(dá)載體是目前較常使用的RNA 干擾技術(shù)之一。

慢病毒載體是從二十世紀(jì)九十年代發(fā)展起來的一種外源性轉(zhuǎn)基因和基因治療載體。它可以在不導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡的條件下在其體內(nèi)復(fù)制，并連續(xù)傳代，具有高效的轉(zhuǎn)染與整合效率。慢病毒載體技術(shù)與siRNA 基因沉默技術(shù)相結(jié)合，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定基因的沉默效應(yīng)。此外，慢病毒載體能夠?qū)⒒蛑委煹幕蛘系饺说娜旧w上，使得該基因能夠穩(wěn)定長(zhǎng)期的表達(dá)，從而達(dá)到治療疾病的目的［15-16］。本研究中，構(gòu)建針對(duì)MIF 特異性的shRNA 慢病毒表達(dá)載體，成功應(yīng)用慢病毒載體感染人肺成纖維細(xì)胞HFL1，感染效率高，感染后可顯著敲低HFL1 的MIF 表達(dá)水平，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

圖4 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞株在不同時(shí)間點(diǎn)的遷移情況Fig.4 Migration of controll group and experimental group at different time points

近年來對(duì)MIF 的深入研究發(fā)現(xiàn)，MIF 與成纖維細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。GU 等［10］以成人皮膚成纖維細(xì)胞（HDFa 細(xì)胞）為研究對(duì)象，觀察外源性重組人MIF 與抗MIF 抗體對(duì)HDFa 細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示加入外源性重組人MIF 后，明顯促進(jìn)了HDFa 細(xì)胞的生長(zhǎng)及膠原蛋白的合成；加入抗MIF 抗體則可顯著抑制HDFa 細(xì)胞的增殖及膠原合成。在另外兩個(gè)小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3 和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）的研究中也發(fā)現(xiàn)，MIF 有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的作用［11，17］。在本研究用CCK8 檢測(cè)敲低MIF 表達(dá)后對(duì)HFL1 增殖的影響，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的OD值來反映細(xì)胞增殖的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 h 時(shí)，對(duì)照組HFL1-sh-NC 和實(shí)驗(yàn)組HFL1-sh-MIF 兩組細(xì)胞的OD值沒有顯著差異；24、48 和72 h 時(shí)，對(duì)照組HFL1-sh-NC 的OD值顯著高于實(shí)驗(yàn)組HFL1-sh-MIF，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明MIF 表達(dá)受抑制后HFL1 的增殖減緩。以上結(jié)果提示MIF 對(duì)人肺成纖維細(xì)胞HFL1 的增殖具有促進(jìn)作用，與文獻(xiàn)報(bào)道的MIF 對(duì)其他物種或其他組織來源的成纖維細(xì)胞的作用相同。

MIF 對(duì)細(xì)胞遷移力的影響因細(xì)胞種類不同而各異。它可以顯著抑制巨噬細(xì)胞的遷移，也因此得名；對(duì)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞也表現(xiàn)類似的作用，使中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在局部趨化聚集，分泌和釋放多種炎癥因子及炎癥介質(zhì)，最終導(dǎo)致局部炎癥發(fā)生。對(duì)腫瘤細(xì)胞，MIF 可以促進(jìn)其遷移及轉(zhuǎn)移［18-20］；對(duì)血管平滑肌細(xì)胞和微血管來源的內(nèi)皮細(xì)胞，MIF 也表現(xiàn)為促進(jìn)其遷移的作用［21-22］。對(duì)成纖維細(xì)胞，DEWOR 等［23］在研究中發(fā)現(xiàn)，MIF 可以通過Ca 通道途徑激活小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs），促進(jìn)其遷移，使刮傷皮膚創(chuàng)口的愈合加快。本研究用Woundhealing 法檢測(cè)敲低MIF 表達(dá)后對(duì)人肺成纖維細(xì)胞HFL1 遷移能力的影響。實(shí)驗(yàn)中使用含絲裂霉素的細(xì)胞培養(yǎng)液抑制細(xì)胞增殖，避免因細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。結(jié)果顯示在24 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組HFL1細(xì)胞的遷移率沒有顯著差異，在30 h 時(shí)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HFL1 細(xì)胞的MIF 表達(dá)下調(diào)后，其遷移率顯著降低。上述結(jié)果提示，MIF 對(duì)人肺成纖維細(xì)胞HFL1 也表現(xiàn)為促進(jìn)其遷移的作用，和DEWOR 等［23］報(bào)道的MIF 對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）的作用相同。

本研究的主要不足在于未對(duì)敲低MIF 表達(dá)后抑制HFL1 的增殖及遷移力的相關(guān)通路和機(jī)制進(jìn)行深入研究。MITCHELL 等［11］和PETRENKO 等［17］的研究發(fā)現(xiàn)MIF 可以通過ERK/MAPKs 信號(hào)通路途徑及E2F/p53 信號(hào)通路途徑促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。此外，有研究提示MIF 可以通過上調(diào)Toll 樣受體4（TLR-4）加強(qiáng)脂多糖誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞增殖［24-25］。MIF 對(duì)人肺成纖維細(xì)胞HFL1 增殖及遷移能力的影響是否也是通過以上通路和機(jī)制尚有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

肺纖維化的主要病理機(jī)制為成纖維細(xì)胞的異常增殖或凋亡不足以及細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，而成纖維細(xì)胞遷移、活化后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并分泌大量的膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一。因此，抑制肺成纖維細(xì)胞的遷移、活化和增殖，有助于控制甚至逆轉(zhuǎn)肺間質(zhì)纖維化。從本研究的結(jié)果看，敲低MIF 表達(dá)后對(duì)人肺成纖維細(xì)胞HFL1 的增殖和遷移能力有顯著的抑制作用，MIF有望成為抗纖維化治療的新靶點(diǎn)。