丁嘉寧 梁利寶 王曰鑫

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院 太谷 030801

腐植酸是土壤中主要的有機(jī)碳庫(kù)，對(duì)土壤生物多樣性的改善有明顯的調(diào)控作用。腐植酸可通過(guò)改變根系分泌物（糖和有機(jī)酸）的種類(lèi)和成分進(jìn)而間接改變微生物群落結(jié)構(gòu)[1]；腐植酸和肥料配施可提高根際土壤中細(xì)菌和真菌的數(shù)量[2]，不同種類(lèi)的腐植酸對(duì)微生物的影響效果不同[3]；腐植酸還可以提高養(yǎng)分的利用率[4，5]。

凌愛(ài)芬[6]采用平板培養(yǎng)法說(shuō)明添加少量腐植酸可以促進(jìn)土壤細(xì)菌數(shù)量的增加，但隨著腐植酸用量增加，細(xì)菌數(shù)量開(kāi)始下降，原因是腐植酸對(duì)微生物產(chǎn)生抑制作用。楊云馬等[7]研究得出土壤細(xì)菌數(shù)量與速效N、P含量呈極顯著正相關(guān)，與速效K呈顯著正相關(guān)。利用高通量測(cè)序技術(shù)研究細(xì)菌多樣性是一種現(xiàn)代的分子生物學(xué)法[8]，克服了傳統(tǒng)平板培養(yǎng)技術(shù)[9]的缺點(diǎn)，獲得了一部分不能分離培養(yǎng)的土壤微生物信息。此方法測(cè)序量大，準(zhǔn)確度高，而且成本低，能夠大量節(jié)省試驗(yàn)的人力、物力。但該方法可能會(huì)高估或低估一些細(xì)菌種群的相對(duì)豐度和多樣性。目前，國(guó)內(nèi)采用高通量測(cè)序方法研究腐植酸肥料對(duì)土壤細(xì)菌種群影響的研究較少，因此本試驗(yàn)采用此法揭示腐植酸對(duì)土壤細(xì)菌種群的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試作物

供試作物為油菜“四月慢”，生育期約為40天，從山西省太谷縣農(nóng)資市場(chǎng)購(gòu)得。

1.1.2 供試肥料

腐植酸鉀肥料從市場(chǎng)購(gòu)得，水溶性腐植酸含量為40%，N含量為 8.8%，P2O5含量為4.5%，K2O含量為10%。

1.1.3 供試土壤

供試土壤類(lèi)型為石灰性褐土，采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)站，土壤的化學(xué)性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 供試土壤的化學(xué)性質(zhì)Tab.1 The chemical properties of tested soil

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院實(shí)驗(yàn)站內(nèi)進(jìn)行，采用盆栽試驗(yàn)，試驗(yàn)用塑料盆規(guī)格為高22 cm，上口徑為20 cm，下口徑為17 cm，每盆裝入6 kg風(fēng)干土。試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)不同腐植酸鉀肥料施用量處理，分別為0、5、10、20 g/kg土，分別用HA1、HA2、HA3、HA4表示，同時(shí)每盆施入基礎(chǔ)肥料尿素2克/盆，磷酸二氫鉀1克/盆，每個(gè)處理重復(fù)3次，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。于2019年5月7日播種，5月12日出苗，每盆保留4棵苗，于6月20日收獲，同時(shí)進(jìn)行土壤樣品的采集，土壤鮮樣采集后立刻進(jìn)行細(xì)菌多樣性的測(cè)定；待土壤風(fēng)干后，進(jìn)行土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

土壤細(xì)菌多樣性采用高通量測(cè)序的方法測(cè)定（委托上海美吉生物科技有限公司測(cè)定）；土壤有機(jī)質(zhì)采用NY/T 85-1988土壤有機(jī)質(zhì)測(cè)定法標(biāo)準(zhǔn)中的重鉻酸鉀容量法測(cè)定；土壤全氮采用NY/T 53-1987土壤全氮測(cè)定法標(biāo)準(zhǔn)中的半微量開(kāi)氏法測(cè)定；土壤全磷采用NY/T 88-1988土壤全磷測(cè)定法標(biāo)準(zhǔn)中的氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法測(cè)定；土壤全鉀采用NY/T 87-1988土壤全鉀測(cè)定法標(biāo)準(zhǔn)中氫氧化鈉熔融-火焰光度法測(cè)定。

1.4 土壤DNA提取和高通量測(cè)序

采用DNA提取試劑盒E.Z.N.A.? Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提取土壤總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。對(duì)16s rRNA基因高變區(qū)（V3-V4）片段進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，引物序列[10]為 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA -3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，接著進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，包括95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；循環(huán)結(jié)束后72 ℃最終延伸5 min。每個(gè)樣品3次重復(fù)，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用Quanti FluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，按照測(cè)序量要求，之后將樣品互補(bǔ)DNA（cDNA）模板量濃度均一化至10 nmol/L后等摩爾混合，最后將混合液逐步稀釋至5 pmol/L后直接上機(jī)測(cè)序。測(cè)序在上海美吉生物科技有限公司的Illumina Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行。

1.5 高通量測(cè)序指標(biāo)及意義

使用Trimmomatic軟件原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接；得到的序列用Uparse軟件進(jìn)行處理，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行聚類(lèi)，形成不同的分類(lèi)單元，即為不同的OTU，使用Uchime軟件剔除嵌合體；利用RDPclassif i f i er軟件平臺(tái)對(duì)OTU進(jìn)行物種分類(lèi)，從而獲得每個(gè)OTU的分類(lèi)學(xué)信息。

1.5.1 稀釋性曲線(xiàn)

稀釋性曲線(xiàn)可以用來(lái)比較測(cè)序不同的樣品中物種的豐富度，也可以用來(lái)說(shuō)明樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否足夠，是否需要加測(cè)數(shù)據(jù)。當(dāng)圖像變化越來(lái)越小甚至幾乎不變，證明測(cè)序數(shù)據(jù)量較為合理，各樣品的覆蓋率均較大，沒(méi)有被測(cè)出的序列概率極低，反映了本次測(cè)序結(jié)果真實(shí)度較高，具有分析意義。

1.5.2 Alpha多樣性分析

（1）計(jì)算菌群豐富度的指數(shù)：包括Chao指數(shù)與Ace指數(shù)，二者均是生態(tài)學(xué)中常用于估計(jì)菌群豐富程度的指標(biāo)，它們可以估計(jì)物種總數(shù)。兩個(gè)指數(shù)與菌群多樣性均呈正相關(guān)關(guān)系，即Chao指數(shù)值與Ace指數(shù)值越大，則所含細(xì)菌越豐富。

（2）計(jì)算菌群多樣性的指數(shù)：包括Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)，二者均是生態(tài)學(xué)中常用于計(jì)算菌群多樣性的指數(shù)。兩個(gè)指數(shù)對(duì)群落種類(lèi)的影響相反，即Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，則群落種類(lèi)越多。

（3）測(cè)序深度的指數(shù)：Coverage指數(shù)能夠體現(xiàn)樣品被覆蓋的程度，與樣品的覆蓋率呈正相關(guān)關(guān)系。也就是說(shuō)，Coverage指數(shù)值越高，樣品的覆蓋率越高，不能被檢測(cè)到的樣品幾率就越低。

1.5.3 物種組成分析

（1）Venn圖分析：可以直接通過(guò)觀察圖中OTU的數(shù)目和各樣品之間的相似度和重疊情況，研究各樣品物種組成的異同點(diǎn)。

（2）群落組成豐度：指群落中物種的數(shù)量多少，即細(xì)菌的豐富水平。

1.5.4 土壤養(yǎng)分與細(xì)菌OTU相關(guān)性分析

利用Spearman相關(guān)性熱圖分析土壤養(yǎng)分與細(xì)菌OTU的相關(guān)性，通過(guò)直接觀察群落熱圖中各指數(shù)的顏色深淺來(lái)判斷各個(gè)環(huán)境因子與細(xì)菌OTU之間的相關(guān)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種注釋與評(píng)估

為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息，采用RDPclassif i er貝葉斯算法對(duì)一定相似度水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)比對(duì)分析，并在門(mén)水平（phylum）統(tǒng)計(jì)各樣品的群落組成。不同的OTU可以注釋為同一物種，此時(shí)該物種的豐度為對(duì)應(yīng)OUT豐度之和。

2.1.1 稀釋性曲線(xiàn)

由圖1可以看出，橫坐標(biāo)為隨機(jī)抽取測(cè)序樣品中的16s rDNA讀數(shù)，即樣品序列數(shù)（reads），其數(shù)值在不斷增加，而縱坐標(biāo)表示的OTU的數(shù)量也隨之呈先快后慢的趨勢(shì)增大。當(dāng)序列數(shù)為0～10000時(shí)，OTU數(shù)目增加速度比較快；當(dāng)序列數(shù)在10000以后，OTU數(shù)目增加的速度逐漸變得緩慢；當(dāng)取樣序列數(shù)達(dá)到30000以后，OTU數(shù)量的增加速度趨于平緩，其數(shù)量幾乎不再改變。因而說(shuō)明選取的樣本數(shù)比較恰當(dāng)，可以切實(shí)地反映土壤樣本的細(xì)菌群落，測(cè)序深度符合要求，能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種。

圖1 樣品稀釋性曲線(xiàn)Fig.1 Rarefaction curves of the samples

2.1.2 Alpha多樣性分析

表2是不同腐植酸鉀肥料處理后土壤細(xì)菌Alpha多樣性分析結(jié)果?？梢钥闯鯤A2的Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)是所有處理中最大的，而Simpson指數(shù)最小，說(shuō)明了HA2的土壤細(xì)菌多樣性最豐富；HA4的Ace指數(shù)和Chao指數(shù)在3個(gè)不同用量腐植酸鉀肥料處理（HA2～HA4）中則是最小的，Shannon指數(shù)也較低，而Simpson指數(shù)最大，說(shuō)明該處理土壤細(xì)菌多樣性最差；HA3的Shannon指數(shù)，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)與HA4相比較大，而Simpson指數(shù)比HA4小。由此說(shuō)明3個(gè)不同用量腐植酸鉀肥料處理土壤細(xì)菌多樣性高于對(duì)照（HA1），且3個(gè)處理中細(xì)菌多樣性由高到低依次為HA2〉HA3〉HA4。由此得出，腐植酸鉀肥料明顯提高了土壤細(xì)菌多樣性。

此外，通過(guò)分析各樣品Coverage指數(shù)和稀釋曲線(xiàn)，不同用量腐植酸鉀肥料處理土壤樣品Coverage指數(shù)均不低于0.9808，即覆蓋率均不低于98.08%，表明每個(gè)樣品的細(xì)菌種類(lèi)信息基本上得到充分表現(xiàn)。

表2 Alpha多樣性分析Tab.2 Alpha diversity analysis

2.2 物種組成分析

2.2.1 Venn圖分析

由圖2中可以看出，4個(gè)不同用量腐植酸鉀肥料處理土壤中共產(chǎn)生4451種OTU，其中4個(gè)不同用量腐植酸鉀肥料處理共同含有2564種OTU。HA1、HA2、HA3、HA4土壤中OTU數(shù)目分別為3339、3643、3491、3650，差異并不十分明顯，它們獨(dú)有的OTU數(shù)量分別為101、84、76、257，差異較為明顯。

綜上可分析出，HA4的OTU數(shù)量和獨(dú)有OTU數(shù)量均最多，HA2的OTU數(shù)量次之，但其獨(dú)有OTU的數(shù)量則僅高于HA3，低于HA1，獨(dú)有的OTU數(shù)量越多表示其含有獨(dú)特的細(xì)菌種類(lèi)也最多。

圖2 OTU分布Venn圖Fig.2 Venn diagram of OTU distribution

2.2.2 群落組成豐度

圖3、圖4分別為OTU水平和門(mén)水平的細(xì)菌群落組成圖。從OTU水平來(lái)看（圖3），排在前5位的OTU分別是：OTU2914、OTU3151、OTU2799、OTU3463、OTU3451。HA3中的OTU2914含量最高3.12%，但與HA1、HA2相比差異不顯著。HA1、HA2中的OTU3151含量分別為2.56%、2.60%，二者之間無(wú)顯著差異，但顯著高于HA3和HA4。HA3中的OTU2799含量為3.60%，顯著高于HA1和HA2，HA4中則沒(méi)有OTU2799。HA1中的OTU3463含量顯著高于其他處理，其余3個(gè)處理中的含量基本相當(dāng)。

圖3 細(xì)菌群落組成圖（OTU水平）Fig.3 Composition of bacterial community (OTU level)

從門(mén)水平來(lái)看（圖4），4個(gè)不同用量腐植酸鉀肥料處理的土壤細(xì)菌群落組成是基本相同的，并且它們的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)也相似，依次為：變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chlorof l exi）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）。4個(gè)不同用量腐植酸鉀肥料處理的土壤變形菌門(mén)含量37.3%～43.8%，其中HA1含量較低；HA1的酸桿菌門(mén)含量（15.0%）顯著高于HA4的含量（11.1%）；HA2的土壤放線(xiàn)菌門(mén)含量（14.4%）要顯著高于HA3（10.2%）。不同用量腐植酸鉀肥料處理的綠彎菌門(mén)含量差異不顯著，均在10%左右；HA1的擬桿菌門(mén)含量（4.20%）則要低于其他處理（5.22%～6.35%），但差異并不顯著。

圖4 細(xì)菌群落組成圖（門(mén)水平）Fig.4 Composition of bacterial community (Phylum level)

隨著腐植酸施用量的增加，在OTU水平上，根據(jù)一定相似度進(jìn)行聚類(lèi)的OTU差異顯著；在門(mén)水平上，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的豐度差異不顯著。綜上表明：腐植酸鉀肥料施入量的增加，改變了土壤菌群的結(jié)構(gòu)，優(yōu)勢(shì)OTU含量減少，降低了相似性，豐富了多樣性。

2.3 不同用量腐植酸鉀肥料處理對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的影響

從表3中可以看出，隨著腐植酸鉀肥料施用量的增加，土壤有機(jī)質(zhì)和氮、磷、鉀含量也隨之增加。3個(gè)不同用量腐植酸鉀肥料處理間差異不明顯，但與對(duì)照均達(dá)顯著水平，說(shuō)明腐植酸鉀肥料可以顯著提高土壤養(yǎng)分含量。

2.4 土壤養(yǎng)分與細(xì)菌OTU相關(guān)性分析

圖5為N、P、K 3種環(huán)境因子與不同細(xì)菌OTU之間的相關(guān)性。由圖可以看出，P、K 2種養(yǎng)分與OTU主要表現(xiàn)為正相關(guān)（棕色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)，且顏色越深相關(guān)性越強(qiáng)）。其中，P元素與OTU1266、OTU3665、OTU835、OTU4327正相關(guān)性較為明顯。K元素與多數(shù)OTU呈正相關(guān)性，其中與OTU2369和OTU329正相關(guān)性最明顯；與P、K元素相比，N元素與較多OTU呈負(fù)相關(guān)性，與OTU1154、OTU1366、OTU3304和OTU3991呈顯著負(fù)相關(guān)，與OTU1366和OTU3304呈極顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明：土壤養(yǎng)分對(duì)不同處理土壤樣品所含OTU的影響既有相似性，又有差異性。

表3 不同用量腐植酸鉀肥料處理土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量Tab.3 Soil organic matter and nutrient content in potassium humate fertilizer treatment with different dosage

圖5 土壤養(yǎng)分與細(xì)菌OTU的Spearman相關(guān)性熱圖Fig.5 Spearman correlation heatmap of soil nutrient and bacterial OTU

3 結(jié)論與討論

（1）不同用量腐植酸鉀肥料處理土壤中細(xì)菌群落組成和優(yōu)勢(shì)菌群均較相似，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)依次為：變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)。原始土壤中酸桿菌門(mén)含量最高，HA4的變形菌門(mén)含量最高，HA2的放線(xiàn)菌門(mén)含量最高。張慧等[11]研究表明，施腐植酸肥料土壤變形菌門(mén)的相對(duì)豐度分別增加2.3%和2.8%，綠彎菌門(mén)和酸桿菌門(mén)略有減少；薛超群等[12]研究得出，隨腐植酸施用量增加，土壤放線(xiàn)菌數(shù)等微生物數(shù)量顯著提高，與本文結(jié)果相似。HA3、HA4放線(xiàn)菌門(mén)含量比HA2低可能因?yàn)楦菜崾┤脒^(guò)多，造成有益微生物群落營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，空間占領(lǐng)，產(chǎn)生抗生素、細(xì)菌素、胞外溶解酶等抑菌物質(zhì)[13]。

（2）OTU2914、OTU3151、OTU2799是不同用量腐植酸鉀肥料處理土壤含量最高的OTU。HA3的OTU2914含量最高3.12%，HA1的OTU2914含量最低為1.41%。HA4的OTU數(shù)量和獨(dú)有OTU數(shù)量均為最多，李想等[14]研究表明不同施肥類(lèi)型土壤微生物的OTU數(shù)量差異明顯，有機(jī)肥處理明顯高于無(wú)機(jī)肥處理，有機(jī)肥處理土壤微生物特有OTU比化肥配施有機(jī)肥處理增加43.55%，說(shuō)明有機(jī)質(zhì)含量越高，微生物OUT數(shù)量也越多。而腐植酸屬于有機(jī)質(zhì)，因此本試驗(yàn)中腐植酸鉀肥料施用量最高的HA4的土壤中OTU數(shù)量較其他處理高。

（3）不同用量腐植酸鉀肥料處理提高了土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量，土壤中P、K 2種養(yǎng)分含量與OTU主要呈正相關(guān)，土壤N含量與細(xì)菌OTU主要呈負(fù)相關(guān)，尤其是N元素與OTU1366和OTU3304呈極顯著負(fù)相關(guān)。袁紅朝等[15]研究得出，N、P、K配施可顯著提高土壤細(xì)菌多樣性，與本文結(jié)果一致。試驗(yàn)所得結(jié)果N元素與OTU呈負(fù)相關(guān)，可能是因?yàn)榈某两?，短期氮沉降不足以打破土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡狀態(tài)[16]，長(zhǎng)期氮沉降增加能提高土壤中NH4+濃度，降低土壤pH值，提高土壤Fe、Al等鹽基離子活性[17，18]，致使高氮沉降量對(duì)土壤微生物群落造成一定的毒害或抑制作用[19]。

本試驗(yàn)只是針對(duì)土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行了研究，并未對(duì)真菌、病毒、原生生物等進(jìn)行研究，因此不能全面反映腐植酸鉀肥料對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響；本試驗(yàn)的供試植物油菜生育期較短，不能長(zhǎng)期反映土壤微生物隨時(shí)空動(dòng)態(tài)變化，今后試驗(yàn)要補(bǔ)充這方面的研究。