萬曉楠,暢曉暉,齊瑋,高欣,喬彬,楊向瑩,李小林,張惠媛,石嵩,張捷*,周熙成

1(北京海關(guān) 技術(shù)中心，北京，100026)2(皇崗海關(guān) 機(jī)關(guān)服務(wù)分中心，廣東 深圳，518000)

甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)是人類病毒性疾病的重要病原體，它是一種無包膜的核糖核酸(RNA)，屬于小核糖核酸病毒科，通過人與人之間的接觸或攝入受污染的水或食物感染健康人群。它廣泛存在于自然界中，感染甲肝病毒的潛伏期可持續(xù)15～50 d[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界約有130萬人死于病毒性肝炎，其中甲型肝炎病毒急性感染約11 000例死亡、戊型肝炎病毒約44 000例死亡，兩者均會(huì)引起肝炎和肝功能衰竭[2]。最常見的食物包括雙殼軟體動(dòng)物貝類、各種鱗莖類蔬菜等易感染此類病毒而引發(fā)疾病，該病毒在冷藏食品也較常見[3]。

傳統(tǒng)的甲型肝炎病毒檢測(cè)方法耗時(shí)費(fèi)力，無法快速有效地檢測(cè)甲型肝炎病毒。比如細(xì)胞培養(yǎng)法，甲型肝炎病毒難以適應(yīng)細(xì)胞，培養(yǎng)周期太長(zhǎng)，因此無法進(jìn)行檢測(cè)。目前甲型肝炎病毒的檢測(cè)方法主要包括分子生物學(xué)、DNA微陣列和電化學(xué)免疫傳感器等。實(shí)驗(yàn)人員采用普通PCR法對(duì)甲肝病毒的目標(biāo)基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，但對(duì)于給定的樣品PCR無法定量負(fù)荷病毒，靈敏度不高，所以該法在檢測(cè)中受限；熒光RT-PCR法，耗時(shí)較短價(jià)格相對(duì)便宜，在實(shí)驗(yàn)室中較為推廣，但精細(xì)操作對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求較高，同時(shí)缺乏對(duì)甲肝病毒感染性的指征。近年來DNA微陣列可以替代PCR法,鑒定樣品序列的單核苷酸多態(tài)性，但其價(jià)格昂貴，不適用于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)[4-6]。電化學(xué)免疫傳感器可以同時(shí)檢測(cè)到不同的甲肝病毒抗原，靈敏度較高，但同樣價(jià)格昂貴，需要大量的納米金顆粒和蛋白A，步驟復(fù)雜從而增加檢測(cè)成本[7]。因此為了進(jìn)一步提高口岸檢出進(jìn)出境食品中甲型肝炎病毒的效率，本研究針對(duì)甲型肝炎病毒，采用近紅外dylight 800熒光染料制備近紅外免疫層析試紙條進(jìn)行快速檢測(cè)，可用于貝類等食品中甲肝病毒的高效檢測(cè)，為進(jìn)出口食品安全監(jiān)管提供可靠的技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 病毒

甲肝病毒，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所提供。

1.2 主要儀器與試劑

高速低溫離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；超純水儀，美國(guó)賽默飛公司；高壓滅菌設(shè)備，江蘇萬創(chuàng)滅菌設(shè)備科技有限公司；近紅外點(diǎn)熒光掃描儀，北京博潤(rùn)福得科技發(fā)展有限公司。

熒光染料dylight 800，美國(guó)賽默飛世爾公司；鼠抗甲肝病毒單克隆抗體(monoclonal antibody,McAb)、羊抗雞免疫球蛋白，上海慧耘生物科技公司、羊抗甲肝病毒衣殼蛋白多克隆抗體，艾博抗Abcam公司；TaqDNA聚合酶、試劑盒，生物工程有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 近紅外熒光染料標(biāo)記甲肝病毒單克隆抗體

標(biāo)記抗體的制備方法如下：

參照文獻(xiàn)[22]所述方法，首先取100 μL磷酸鹽緩沖液稀釋好的鼠抗甲肝病毒單抗(質(zhì)量濃度為1 mg/mL)，然后加入dylight 800熒光染料渦旋混勻后于室溫避光。1 h后加入100 μL磷酸鹽緩沖液混勻，終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。

劃膜抗體的制備方法如下：

參照文獻(xiàn)[22]所述方法,用劃膜液稀釋羊抗甲肝病毒多抗1.5 mg/mL，最后將標(biāo)記抗體放入磷酸鹽緩沖液中，4 ℃透析過夜，回收抗體作為最終標(biāo)記抗體。

2.2 甲肝病毒近紅外免疫層析試紙條的制備

將樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜、吸水墊及反應(yīng)支持基質(zhì)按圖1所示依次搭接，切割機(jī)將其切成試紙條。采用劃線機(jī)，將劃膜抗體(羊抗甲肝病毒多抗1.5 mg/mL)和羊抗雞IgY多抗劃在抗體承載膜上，分別作為檢測(cè)線(T)和質(zhì)控線(C)，檢測(cè)線、質(zhì)控線間距0.5 cm，室溫風(fēng)干。

1-樣品墊；2-結(jié)合墊(含有近紅外熒光染料標(biāo)記抗體的玻璃纖維素膜)；3-硝酸纖維素膜(抗體承載膜)；4-檢測(cè)線；5-質(zhì)控線；6-吸水墊；7-反應(yīng)支持基質(zhì)

2.3 定性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)人員使用配制好的層析緩沖液分別稀釋標(biāo)記抗體(鼠抗甲肝病毒單抗)和羊抗雞免疫球蛋白IgY(稀釋比為1∶50、1∶2 000)(質(zhì)量濃度0.5 mg/mL)，鼠抗甲肝病毒單抗稀釋液與羊抗雞免疫球蛋白IgY 按1∶1比例渦旋混勻。隨后在上述溶液中，滴加甲肝病毒稀釋液(100 μL病毒稀釋液+4 μL混合液)渦旋混勻，滴加至制備好的近紅外免疫層析試紙條樣品墊上，充分反應(yīng)15 min后，采用便攜式近紅外熒光掃描儀檢測(cè)。

2.4 定量檢測(cè)

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：用PBS稀釋液(含5%BSA、0.1%Tween 20)將1 mg/mL的HAV抗原(HAV 抗原為猴腎細(xì)胞培養(yǎng)后的滅活全病毒)進(jìn)行倍數(shù)系列稀釋，分別按照表1，制成不同濃度的稀釋樣品；根據(jù)數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)原理，繪制成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。每個(gè)稀釋度樣本平行測(cè)量2次，取平均值作為測(cè)量值，以該值對(duì)應(yīng)的樣品濃度作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

表1 甲肝病毒實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系

2.5 特異性實(shí)驗(yàn)

在無菌條件下，將5種食源性病毒包括腺病毒、諾如病毒、輪狀病毒W(wǎng)a、輪狀病毒SALL和腸道病毒71型(EV71)原液稀釋，稀釋液按3∶7體積比與4 μL制備好的層析混合液渦旋混合，隨后滴加到樣品墊上，室溫放置15 min后，近紅外熒光掃描儀檢測(cè)近紅外免疫層析試紙條。

3 評(píng)價(jià)方法

3.1 RT-PCR檢測(cè)方法

貝類、海螺絲、蟶子等15份樣品，均來自北京海關(guān)技術(shù)中心食品實(shí)驗(yàn)室。

貝類、海螺絲等前處理方法均按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行檢測(cè)。

3.2 甲肝病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR

引物序列如下所示：

正向引物5’-TTTCCGGAGCCCCTCTTG-3’，

反向引物5’-AAAGGGAAATTTAGCCTATAGCC-3’

探針序列5’-FAM-ACTTGATACCTCACCGCCG TTTGCCT-TAMRA-3’

采用甲肝病毒試劑盒試劑盒：sureFast Norovirus/Hepatitis A 3plex。

3.3 染毒實(shí)驗(yàn)組貝類樣品的處理

用鑷子等工具分別稱取貝類、海螺絲、蟶子等樣品(未檢出甲肝病毒)各消化腺1g，用7 mL甘氨酸緩沖液(pH 9.6)用超聲波方法對(duì)消化腺進(jìn)行粉碎，并將上清液加入，進(jìn)行樣品濃縮。

3.4 用實(shí)際樣品進(jìn)行符合性評(píng)價(jià)

按照所建立的甲肝病毒近紅外免疫層析法，對(duì)15份實(shí)際樣品(北京海關(guān)技術(shù)中心食品實(shí)驗(yàn)室)進(jìn)行檢測(cè)，并將近紅外檢測(cè)結(jié)果與熒光RT-PCR法進(jìn)行比較。

3.4.1 貝類樣品甲肝病毒的富集

按照3.3建立的方法，15份貝類樣品進(jìn)行前處理后充分研磨。采用離心分離過濾膜過濾的方式形成待測(cè)物。

3.4.2 檢測(cè)

來自實(shí)驗(yàn)室的15份貝類樣品分別按照3∶7比例再加4 μL混合液滴加到近紅外免疫試劑條樣品墊上，分別做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，室溫反應(yīng)15 min后用近紅外熒光掃描儀檢測(cè)。

4 結(jié)果分析

4.1 定性檢測(cè)

根據(jù)2.3定性檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)若貝類、蟶子等食品樣品中含有甲型肝炎病毒(目標(biāo)病毒)，目標(biāo)病毒將與結(jié)合墊中的熒光標(biāo)記單抗形成甲肝病毒抗原-抗體復(fù)合物。然后抗原抗體復(fù)合物通過毛細(xì)管作用移動(dòng)至檢測(cè)線，發(fā)生抗原抗體免疫反應(yīng)，被它們各自的特異性多抗捕獲。結(jié)果表明，若甲肝病毒近紅外免疫層析試紙條質(zhì)控線(T)區(qū)域不存在(未出現(xiàn)熒光發(fā)射峰)，則認(rèn)為該測(cè)試無效。若T線區(qū)域、C線區(qū)域同時(shí)出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則認(rèn)為檢測(cè)結(jié)果為陽性；若僅T線區(qū)域測(cè)試出現(xiàn)熒光發(fā)射峰則為陰性結(jié)果。

圖2 甲肝病毒低噪聲激發(fā)式熒光檢測(cè)圖

4.2 定量檢測(cè)

按照2.4定量檢測(cè)方法進(jìn)行試驗(yàn)，用移液器加50 μL已知濃度的甲肝病毒至樣品墊，待樣品吸收后再滴加50 μL配制好的層析液,室溫靜置10 min。低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀檢測(cè)甲肝病毒標(biāo)準(zhǔn)品，樣品中的目標(biāo)檢測(cè)物甲肝病毒采用近紅外光標(biāo)記，甲肝病毒濃度通過反射光強(qiáng)度表征。掃描獲得檢測(cè)線(T)和質(zhì)控線(C)的熒光峰值，若兩者同時(shí)出現(xiàn)發(fā)射峰，則為陽性樣品。將樣品測(cè)試2次后取平均值，檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 不同質(zhì)量濃度甲肝病毒標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)檢測(cè)結(jié)果

以檢測(cè)峰值對(duì)相應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖3所示得出計(jì)算公式Y(jié)=0.018 8x+0.232 5，R2=0.958 8。結(jié)果顯示，甲肝病毒質(zhì)量濃度在1～100 μg/mL時(shí)，熒光比值與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，即線性范圍1～100 μg/mL。檢測(cè)限為1 μg/mL。

圖3 甲肝病毒近紅外免疫層析標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.3 特異性實(shí)驗(yàn)

按照2.5實(shí)驗(yàn)方法將5種病毒包括諾如病毒、輪狀病毒W(wǎng)a病毒株(rotavrius strain Wa)、腸道病毒71型(EV71)等原液稀釋后，分別滴加入甲肝病毒近紅外免疫層析試紙條進(jìn)行檢測(cè)。僅甲肝病毒檢測(cè)線區(qū)域和質(zhì)控線區(qū)域出現(xiàn)熒光峰值，其余5種病毒均未出現(xiàn)檢測(cè)線發(fā)射峰。由此可見本團(tuán)隊(duì)研制的甲肝病毒免疫層析試紙條與腺病毒、腸道病毒EV71、輪狀病毒、諾如病毒等均無交叉反應(yīng)。

4.4 近紅外免疫層析法、熒光RT-PCR法比較

按照3.4實(shí)驗(yàn)方法對(duì)北京海關(guān)技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室15份貝類樣品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)15份貝類、蟶子等樣品的近紅外免疫層析法和熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，結(jié)果均為陰性(如表3所示)。甲肝病毒近紅外熒光法與熒光RT-PCR法的符合率達(dá)到100%。

表3 本方法與熒光RT-PCR法比較

5 討論

甲型肝炎病毒是一種正鏈RNA病毒，非細(xì)菌性肝炎的重要病原體[2]，易被其感染的食物類別多為海鮮，包括貝類、蟶子、生的肉類等缺少熱處理的食品[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)，甲型肝炎病毒(HAV)感染通常是自限型的并且誘導(dǎo)永久的主動(dòng)免疫。目前RT-PCR是最為通用、常見的檢測(cè)法，但其檢測(cè)特異性和靈敏性不是很高[12]。近年來，澳大利亞、美國(guó)、日本等檢測(cè)食源性甲肝病毒，通常采用RT-PCR檢測(cè)目標(biāo)基因，可達(dá)到10～40 copy的病毒核酸。但由于食品種類繁多，成分較為復(fù)雜，大多會(huì)富含RT-PCR的抑制劑，靈敏度會(huì)很大程度地減低，因此該法存在一些局限性。20世紀(jì)90年代初期，研究人員采用斑點(diǎn)金免疫結(jié)合法進(jìn)行甲肝病毒抗體的檢測(cè)[13]。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單快捷，膠體金試劑保存時(shí)間長(zhǎng)，但實(shí)驗(yàn)人員易將弱陽性標(biāo)本誤讀，性價(jià)比和準(zhǔn)確度不高。基因芯片檢測(cè)法具有信息量大、高度平行化和集成化等特點(diǎn)，適用于各種病原體的篩查和診斷。目前基因芯片法需建立穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)程序才能在病毒篩查和傳染病的預(yù)防中廣泛應(yīng)用[14]。2014年喬煜婷等[15]將制備的特異性甲肝病毒免疫磁珠與SYBR-GREEN熒光定量技術(shù)聯(lián)合使用成功檢測(cè)了水體中的甲型肝炎病毒，該法主要適用于環(huán)境中甲肝病毒污染狀況的評(píng)價(jià)。

近年來，近紅外熒光免疫層析技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境微生物、生物物理學(xué)等各領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[16-18]。近紅外免疫層析技術(shù)是將近紅外熒光與免疫層析技術(shù)相結(jié)合的一種新型側(cè)向流技術(shù)，具有背景熒光低、檢測(cè)信噪比高，檢測(cè)靈敏度高的特點(diǎn)。2017年JIHANE等[19]通過將甲肝病毒HAV固定在碳納米粉末糊狀電極的表面上，開發(fā)了用于甲型肝炎病毒抗原(HAV)檢測(cè)的間接競(jìng)爭(zhēng)性電化學(xué)免疫傳感器，具有良好的穩(wěn)定性和高生物選擇性，也成功應(yīng)用于水樣中HAV的測(cè)定，但檢測(cè)成本昂貴，操作步驟繁瑣，難以在實(shí)驗(yàn)室推廣。本研究利用近紅外染料標(biāo)記抗體，依據(jù)雙抗體夾心免疫層析原理制備甲肝病毒免疫層析試紙條，選用熒光探針Dyligh 800信噪比較高，靈敏度較高，生物基體極少在該區(qū)域自發(fā)熒光，使得背景熒光干擾較少?；?50 nm波長(zhǎng)的熒光免疫層析試紙條對(duì)甲肝病毒的最低檢測(cè)限為1 μg/mL。

2015年開始本團(tuán)隊(duì)采用近紅外熒光染料dyllight 800作為標(biāo)記，研制出一系列近紅外熒光免疫層析試紙條檢測(cè)食源性致病微生物, 檢測(cè)對(duì)象包括沙門氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、諾如病毒等[20-23]。本研究將近紅外熒光探針與免疫層析技術(shù)結(jié)合制備了甲肝病毒近紅外免疫層析試紙條，該試紙條能夠應(yīng)用于進(jìn)出口食品類樣品中的甲肝病毒實(shí)時(shí)檢測(cè)，具有結(jié)果準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)，同時(shí)便于攜帶，能夠?yàn)槭称钒踩谋O(jiān)管、現(xiàn)場(chǎng)查驗(yàn)提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

致謝感謝中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所張曉光老師研究團(tuán)隊(duì)和中國(guó)科學(xué)研究院理論物理所舒咬根研究團(tuán)隊(duì)對(duì)本研究的大力支持和幫助。